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紫外吸收法测定核酸的含量

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14026

一、目的

学习紫外分光光度法测定核酸含量的原理和操作方法,熟悉紫外分光光度计的基本原理和使用方法。

二、原理

核酸、核苷酸及其衍生物的分子结构中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统(-C=C一C=C-),能够强烈吸收250-280nm 波长的紫外光。核酸(DNA,RNA)的最大紫外吸收值在260nm 处。遵照Lambert-Beer 定律,可以从紫外光吸收值的变化来测定核酸物质的含量。

在不同pH 溶液中嘌呤、嘧啶碱基互变异构的情况不同,紫外吸收光也随之表现出明显的差异,它们的摩尔消光系数也随之不同。所以,在测定核酸物质时均应在固定的pH溶液中进行。

核酸的摩尔消光系数(或吸收系数),通常以ε(ρ)来表示,即每升含有一摩尔核酸磷的溶液在260nm 波长处的消光值(即光密度,或称为光吸收)。核酸的摩尔消光系数不是一个常数,而是依赖于材料的前处理、溶液的pH 和离子强度发生变化。它们的经典数值(pH = 7.0)如下:

DNA 的ε(ρ)= 6 000 - 8 000

RNA 的ε(ρ)= 7 000 - 10 000

小牛胸腺DNA 钠盐溶液(pH = 7.0)的ε(ρ)= 6 600,DNA 的含磷量为9.2%,含1μg/mL DNA 钠盐的溶液光密度为0.020。RNA 溶液(pH = 7.0)的ε(ρ)= 7 700-7 800,RNA 的含磷量为9.5%,含1μg /mL RNA 溶液的光密度为0.022-0.024。采用紫外分光光度法测定核酸含量时,通常规定:在260nm 波长下,浓度为1μg/mL 的DNA 溶液其光密度为0.020,而浓度为1μg/mL 的RNA 溶液其光密度为0.024。

因此,测定未知浓度的DNA(RNA)溶液的光密度OD260nm,即可计算测出其中核酸的含量。该法简单、快速、灵敏度高,如核酸3μg/mL 的含量即可测出。对于含有微量蛋白质和核苷酸等吸收紫外光物质的核酸样品,测定误差较小,若样品内混杂有大量的上述吸收紫外光物质,测定误差较大,应设法事先除去。由于降解或水解作用,核酸的光密度可以增高约40%,这就是众所周知的增色效应(hyperchromic effect)。在大分子的核酸中,氢键和π-键相互作用改变了碱基的共振行为。因此,核酸的光密度低于构成它的核苷酸的光密度,该现象称为减色效应(hypochromic effect)。

三、实验材料、主要仪器和试剂

1.试材:核酸样品DNA 或RNA。

2. 主要仪器

(1)分析天平

(2)紫外分光光度计

(3)冰浴或冰箱

(4)离心机

(5)离心管(10mL)

(6)烧杯(10mL)

(7)容量瓶(50mL、100mL)

(8)移液管(0.5ml、2mL 和5mL)

(9)药品勺和玻璃棒

(10)试管和试管架。


3.试剂

(1)5%~6%氨水:用25%~30%氨水稀释5 倍。

(2)钼酸铵-过氯酸试剂:取3.6mL70%过氯酸和0.25g 钼酸铵溶于96.4mL 蒸馏水中。

四、操作步骤

1.核酸样品纯度的测定

(1)准确称取待测的核酸样品0.5g,加少量蒸馏水(或无离子水)调成糊状,再加适量的水,用5%-6%氨水调至pH7,定容至50mL.

(2)取两支离心管,甲管内加入2mL 样品溶液和2mL 蒸馏水;乙管内加入2mL 样品溶液和2mL 沉淀剂(沉淀除去大分子核酸,作为对照)。混匀,在冰浴(或冰箱)中放置30min,3 000r/min 离心10min。从甲、乙两管中分别取0.5mL 上清液,用蒸馏水定容至50mL.选用光程为1cm 的石英比色杯,在260nm 波长下测其光密度。

(3)计算

 

如果待测的核酸样品不含酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸,则可将样品配制成一定浓度的溶液(20-50μg/mL)在紫外分光光度计上直接测定。

2.核酸溶液含量的测定

当待测的核酸样品中含有酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸,在测定时需要加钼酸铵-过氯酸沉淀剂,沉淀除去大分子核酸,测定上清液260 nm 处光密度作为对照。

(1)取2 支离心管,每管各加入2mL 待测的核酸溶液,再向甲管内加2mL 蒸馏水,向乙管内加2mL 沉淀剂。混匀,在冰浴(或冰箱)中放置10min,3 000r/min 离心10min。将甲、乙两管清液分别稀释至光密度在0.1-1.0 之间。选用光程为1cm 的石英比色杯,在260nm 波长下测其光密度OD260nm。

(2)计算

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