胶体金标记蛋白的制备

基本原理

胶体金标记实质上是抗体蛋白等生物大分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附的机理可能是胶体金表面所带的负电荷与蛋白质分子所带的正电荷之间靠静电力相互吸引，达到范德华引力内即形成牢固的结合。另外，胶体金颗粒的粗糙也是有利于形成吸附的重要条件。由于这种标记过程主要是靠物理吸附作用，因而对蛋白质分子的生物学活性没有明显影响。

试剂及材料

1. 胶体金溶液；
2. 待标记蛋白；
3. 0.1mol/L K2CO3；
4. 1%聚乙二醇（PEG，分子量20KD）；
5. 0.05mol/L，pH9.0硼酸盐缓冲液；
6. 10% NaCl溶液；
7. 超速离心机。

操作方法

1. 待标记蛋白质前处理：将待标记蛋白溶液预先对0.05mol/L ，pH7.0 NaCl 4℃透析过夜，去除多余的盐离子，再经10000g 4℃离心1h，去除聚合物。

2. 胶体金溶液的前处理：胶体金对蛋白质的吸附主要取决于pH值，在接近蛋白质的等电点或略偏碱的pH条件下，二者容易形成牢固的结合物。如果胶体金的pH值低于蛋白质的等电点时，则会聚集而失去结合能力。因此预先调节胶体金的pH值尤为重要（用0.1mol/L K2CO3或0.1mol/L HCl）

①标记IgG时，胶体金溶液的pH值调节至9.0；
②标记McAb时， 胶体金溶液的pH值调节至8.2；
③标记亲和层析抗体时， 胶体金溶液的pH值调节至7.6；
④标记SPA时， 胶体金溶液的pH值调节至5.9-6.2；
⑤标记亲和素时， 胶体金溶液的pH值调节至9.0-10.0；
⑥标记链霉亲和素时， 胶体金溶液的pH值调节至7.4或6.6；

3. 待标记蛋白质与胶体金用量比例的确定
①根据标记蛋白质的要求，调节胶体金溶液的pH值后，分装10管，每管1ml；
②将待标记蛋白质(以IgG为例)用0.05mol/L，pH9.0硼酸盐缓冲液作系列稀释为5-50mg/ml，分别取1ml加入1管胶体金溶液中.对照组加1ml稀释液(不含蛋白质)，混匀；
③放置5min后，在上述各管内加入0.1ml 10% NaCl溶液，混匀静置2h，观察结果；
④未加蛋白质（对照管）和加入蛋白质的量不足以稳定胶体金的各管，呈现由红色变为兰色的聚集现象；而假如蛋白质的量达到或超过最低稳定量的各管仍保持红色不变。其中含蛋白质最低的试管即为稳定1ml胶体金所需的蛋白质量，在此基础上再加10%-20%，即为待标记蛋白（IgG）的实际用量。

4. 胶体金与蛋白质的结合

下面分别介绍抗体、葡萄球菌A蛋白与胶体金结合的操作过程。

①抗体蛋白(IgG)的标记
A）按上述方法确定两种试剂的最适用量后，分别取所需量的胶体金和相应的抗体蛋白（IgG），用用0.1mol/L K2CO3调节pH值至9.0；
B）在搅拌下将胶体金溶液和抗体蛋白液混合；
C）10min后，加入一定量的稳定剂，以防止抗体蛋白和胶体金的聚合和发生沉淀。常用5%BSA ，使其终浓度为1%，或加入1%聚乙二醇至标记总量的10%；

②葡萄球菌A蛋白(SPA)的标记
A）取高纯度的SPA溶于0.1-0.2ml的蒸馏水中，
B）将胶体金溶液的pH值调至6.0；
C）按以下组合将SPA与胶体金混合： 30mg SPA，加入10ml 15nm胶体金溶液； 60mg SPA，加入10ml 3nm胶体金溶液； 80mg SPA，加入10ml 8-13nm胶体金溶液；
D）混合3min后，没25ml SPA-胶体金结合物内加入1ml 1%PEG溶液。

5. 胶体金标记蛋白的纯化（超速离心法）

根据胶体金颗粒的大小、标记蛋白的种类及稳定剂不同，选用不同的离心速度：

①以BSA作稳定剂的胶体金-羊抗鼠IgG结合物
A）先低速离心，弃去聚集的胶体金颗粒，一般为5nm用9000r/min 离心20min；20nm用2000r/min 离心20min；
B）再高速离心：5nm胶体金结合物，60000g，4℃离心1h；20-40nm胶体金结合物，14000g，4℃离心1h；
C）仔细吸去上清，沉淀物用含1%BSA的0.01mol/L，pH7.6 PB混悬至原量；
D）平衡过夜后，同上重复离心2次，最后用1%BSA的0.01mol/L，pH7.6 PB(0.02%NaN3 ) 混悬至原量的1/10，分装， 4℃保存。结合物内加50%的甘油可贮存于-18℃一年以上。

②以PEG为稳定剂的胶体金-SPA结合物
A）高速离心：3-5 nm胶体金结合物，100，000g，4℃离心1.5-2h；8-13 nm胶体金结合物，80，000g，4℃离心1h；15 nm胶体金结合物，60，000g，4℃离心45min-1h；
B）仔细吸去上清，沉淀物用0.01mol/L，pH7.6 PBS混悬至原量；
C）同上重复离心2次，以保证除净未结合的SPA，最后用0.01mol/L，pH7.6 PBS(0.02%NaN3 ) 混悬至原量的1/20，分装， 4℃保存。结合物可保存数年。

6. 胶体金-蛋白结合物的质量鉴定

①胶体金颗粒平均直径的测定
②胶体金-蛋白质溶液的OD520 nm值的测定：一般应用液的OD520 nm值应为0.2-0.4。
③金标蛋白的特异性与敏感性的测定：见胶体金标记技术的应用。