胶体金标记蛋白A技术

胶体金标记蛋白A技术（Protein A-gold technique, PAg法）
　　 PAg复合物制备方法简便，作为第二抗体，无种属特异性，可以免去不同种属动物要制备不同的特异性免疫球蛋白。PAg 复合物与包埋剂和细胞成分都极少发生非特异性的交互作用，蛋白A和金粒间非共价的结合特性既不影响蛋白A的活性，又能保持高度的稳定性，PAg复合物分子最小易于穿透组织。PAg复合物的原液在4℃可保存达一年之久。电镜水平的PAg染色法 PAg法在电镜技术的应用原则是二步标记法，可用于包埋前和包埋后染色。其主要区别于一般胶体金免疫染色在：①须1%卵白蛋白－PBs （pH7.4）或1%卵白蛋白―0.05mol/l Tris缓冲液（pH7.4）来封闭非特异性的结合部位，而不是采用羊或其它的动物的正常抗血清，因为PAg复合物能够与正常血清组中的Ig结合，从而给出假阳性结果；②在应用第一抗血清孵育和PBS冲洗后作第二抗血清即PAg复合物孵育前的准备时，应用的PBS或TBS的pH应变更为pH8.2。其它可参照本节中包埋后染色法进行。
液体配制：
1、 胶体金稀释液配方：
（PH＝8.2）的0.02mo1／L Tris TBS缓冲液，加入试剂级卵清白蛋白至1％。｛免疫电镜按1：20-50稀释，淡红色为适宜稀释液,胶体金稀释后应于当天使用，未用完的应该丢弃。（免疫胶体金说明书）｝
2、 清洗液：
0.5mol／L，pH7.4 Tris-Hcl缓冲液：Tris，60.57g，1mol／L Hcl约420m1，调pH值至7.4，最后加双蒸水至1000m1，此为储备液。
0.05mo1／L Tris缓冲生理盐水：氯化钠8.5-9g；0.5mo1／L，pH7.4 Tris-Hcl缓冲液100m1；加双蒸水至1000m1，调pH值至7.4。
0.02mo1／LTris缓冲生理盐水：氯化钠8.5-9g；o.5mo1／L，pH7.4 Tris-Hcl缓冲液40m1，加双蒸水至l000m1，调pH值至8.2。
3、 H2O2的配制:3% H2O2
4、 8％过碘酸钠水溶液
5、 封闭液：
前封闭液：1%卵白蛋白―0.05mo1／LTris缓冲液（pH7.4）；
后封闭液以及胶体金稀释液：1%卵白蛋白―0.02mo1／LTris缓冲液（pH8.2），后封闭为胶体金结合作准备。
具体操作:
一、包埋：常规电镜制样，样品只需要戊二醛固定，不需要锇酸后固定。丙酮梯度脱水时70％的丙酮中没有添加染色剂。样品于37度烘箱中固化。
二、切片：
超薄切片厚50～70nm左右，载于300网孔的镍网上。
三、抗原修复：
1、置1%H2O2内10min至1h（视树脂的硬度和切片的厚度而定），以去锇酸和增进树脂穿透性，有利抗体进入。如切片很薄或于低温包埋时，此步可省略。操作时，滴入1%H2O2液1滴于蜡板上，将网的载片面轻浮于液滴上。对中枢神经系统切片，有主张以1%过碘酸钾（KIO4）代替H2O2的。
（同时用8％过碘酸钠水溶液代替双氧水，室温5～25分钟以及丙酮对环氧树脂进行溶解。看三者那个效果最好）
2、双蒸水洗3次，每次10min，第1，2次浮于液滴上清洗，第3次以盛双蒸水的注射器沿镍网面冲洗，水流应有适当压力，但不宜过高强，用滤纸在网缘将水吸干。(0.05mo1／L TBS pH7.4洗5min×3次?)
三、封闭以及免疫反应：
1、载有超薄片的镍网或金网浮于1%卵白蛋白－TBS（7.4）液滴上，室温约1h，阻断非特异性吸附，吸去多余血清，不洗。
2、载网直接移至第一抗血清液滴上(抗体稀释度较常规免疫组化低l倍)，在室温孵育2h或4℃18～24h。
3、0.05mo1／L TBS pH7.4，洗5min×3次。0.02mo1／L TBS PH8.2，洗5min×3次。1％卵清白蛋白0.02mo1／L TBS（8.2） 37℃孵育l h，再次阻断非特异性吸附，吸去多余液体，不洗。
4、将PAg原液稀释10～20倍（1：30～1：100，淡红色为适宜稀释液），载网浮于该液滴上，室温孵育10min至1h（37℃孵育2h？）。
5、0.02mo1／L TBS pH8.2，洗5min×3次。0.05mo1／L TBS pH7.4，洗5min×3次。最后切片浸于0.05m01／L TBS pH7.4缓冲液中，送电镜室处理（含2%戊二醛及3%多聚甲醛的TBS液固定30分钟？）。
四、电子染色以及电镜观察：
1、5%醋酸铀（双蒸水配制）染5min，然后用双蒸水洗。
　　2、枸橼酸铀（或醋酸铅）染色5min，双蒸水洗净。
3、H－600透射电镜观察。
免疫胶体金试验成功的要求：
抗体高度特异性和亲和力以及被检组织内抗原含量高；标本的前处理和染色也至关重要。
取消锇酸后固定，聚合温度不宜高于45度，可以选用37度12小时，45度48小时作为聚合温度。试验全过程应保持网面的湿润。缓冲液要清洁，最好用新鲜配制的或经微孔滤纸过滤后使用。
染色前所用器皿必须清洁干净且专用，并用双蒸水冲洗三遍，染色程序中的洗涤必须充分，以减少背景染色。尤其双重免疫标记的切片染色时，第一次金标二抗孵育后必须充分洗涤，以不影响第二次金标二抗的反应结果。摘自:贾云香,卓夏阳,顾云娣.双重胶体金标记的免疫电镜技术.江西医学院学报,2003,43(4):22-24
将免疫组织化学技术与电子显微镜技术相结合，则可以利用电子显微镜高分辨率的优点，在超显微结构水平定位细脑内的特异性抗原。为疾病的病因、发病机理、组织来源等方面的探索研究，为提高疾病的认识与诊断提供可靠的手段。
1) 试剂配制：
(1)4％多聚甲醛一0.01％戊二醛溶液：多聚甲醛4g，0.2m01／L二甲砷酸钠缓冲液(内含0.2mol／L蔗糖，0.4mmo1／L CaCl2)50 m1，20％戊二醛40ul，双蒸水加至100m1。
(2)0.5mol／L，pH7.4 Tris-Hcl缓冲液：Tris，60.57g，1mol／L Hcl约420m1，调pH值至7.4，最后加双蒸水至1000m1，此为储备液。
(3)0.05mo1／L Tris缓冲生理盐水：氯化钠8.5-9g；0.5mo1／L，pH7.4 Tris-Hcl缓冲液100m1；加双蒸水至1000m1，调pH值至7.4。
(4)0.02mo1／LTris缓冲生理盐水：氯化钠8.5-9g；o.5mo1／L，pH7.4 Tris-Hcl缓冲液40m1，加双蒸水至l000m1，调pH值至8.2。
(5)0.5mo1／L，Triton-Tris缓冲生理盐水：Tritonx-100 l0m1;0.5mo1／L，pH7.4 Tris-Hcl缓冲液100m1，加双蒸水至l000m1，调pH值至7.4。

2)具体步骤:
(1)0.05mo1／L TBS(pH7.4)洗5min×3次。
(3)1：5正常羊血清(0.05mo1／L TBS PH7.4)37℃孵育l h，阻断非特异性吸附，吸去多余血清，不洗。
(4)特异性一抗(抗体稀释度较常规免疫组化低l倍)室温孵育24h。
(5)0.05mo1／L TBS pH7.4，洗5min×3次。
(6)0.02mo1／L TBS PH8.2，洗5min×3次。
(7)1：5正常羊血清(0.02mo1／L TBS pH8.2)37℃孵育l h，再次阻断非特异性吸附，吸去多余血清，不洗。
(8)生物素化胶体金标记二抗(原液)37℃孵育2h。
(9)0.02mo1／L TBS pH8.2，洗5min×3次。
(10)0.05mo1／L TBS pH7.4，洗5min×3次。
(11)最后切片浸于o．05m01／L TBS pH7．4缓冲液中，送电镜室处理.

无DNA酶的胰RNA酶 将胰RNA酶溶解于10mmol/LTris-Hcl(PH7.5),15mmol/LNaCl中,配成10mg/ml的浓度,与100度加热15分钟,缓慢冷却至室温,分装成小份－20度保存.
病毒液体的胶体金技术：
（自：傅仓生，胶体金免疫电镜技术用于烟草花叶病毒的检测，植物病理学报，VoL．24，No．4，353―355）1.3.1 外标记标本制备： (1)以带膜铜网蘸取纯化病毒悬液，PBS冲洗。(2)在相应的抗血清中室温孵育20分钟，PBS冲洗。(3)在PAg(1：50稀释)中室温孵育20分钟，PBS冲洗。(4)1％醋酸铀负染，H500电镜观察，拍照。
内标记标本制备： (1)以感染烟草花叶病毒的普通烟叶的试料，电镜常规制样，超薄切片。(2)在TMV抗血清中室温孵育l小时，PBS冲洗数次。(3)在PAg(1：50稀释)中室温孵育1小时，PBS冲洗数次，三蒸水冲洗数次。(4)醋酸铀一柠檬酸铅双染色，H500电镜观察，拍照。
（自：翟雷，朴晓萍，潘萍等。微生物学免疫学进展，1995，24（3）：17-19。免疫胶体金试剂的制备及应用胶体金免疫电镜技术检测戊型肝炎病毒）取样品100 ul分别于微量离心管，各加100 ul鼠抗HEV单克隆抗体(1：500一1000稀释)，混匀， 37℃温箱作用60min，双蒸水充满管，13000 rPm离心30 min，弃上清．沉淀用100 ul双蒸水悬浮，加l00ul胶体金标记免抗鼠IgG，温匀，置37℃温箱作用60 min．双蒸水充满管，13000rPm离心30min，弃上清，沉淀用l00ul双蒸水悬浮，滴于镀膜铜网，干后3％PH7.4的PTA负染，电镜观察。
（自：滴一滴NDV于铜网上，室温吸附15分钟，然后用0.1％的PBS洗5次，吸去余液；加一滴金标抗体于铜网上，37度作用20分钟，PBS洗5次，吸去余液，然后用磷钨酸负染5分钟，干燥后电镜观察。
（自：梁红，谭红英，蔡景霞等。蛋白A胶体金免疫电镜负染技术检测脊髓灰质炎病毒和SV40病毒，中华微生物和免疫学杂志，1998，9（2）：111－112） 取抗原抗体各50UL在血凝板孔中37度，45分钟。加OD值为0.2胶体金50UL，37度，45分钟。取抗原抗体胶体金混和物50UL，于铜网，室温30分钟。胶体金缓冲液洗两次，双蒸水洗一次，磷钨酸负染，电镜检查。