内参照定量PCR

设置内参照是理想的定量方法，它使定量测定mRNA工作变得较为简单易行，这一类方法已较为广泛地应用，下面介绍两种常用的方法。

是指合成cRNA内参照的定量PCR，其基本方法是首先构建一个内参模板的质粒，在它的T7启动子下游依次排列有若干个不同的靶mRNA的5端引物序列，接下来排列有相对应的若干个3端引物序列及PolyA序列。用T7聚合酶转录cRNA，利用其cRNA的PolyA经oligo(dT)纯化后测定含量，再与靶基因的总RNA一起进行逆转录，将两者的逆转录产物作为模板一起作PCR扩增，并用同位素末端标记。

由于两者扩增产物条带大小不同，因此可在PAGE电泳凝胶中区分开来，将扩增条带回收后，分别测定其放射活性强度，然后对模板的浓度作图。因为内参照与特异的mRNA在同一体系中的共同扩增效率在PCR对数期内是相同的，因此,可用标准曲线对特异mRNA进行定量。现以质粒AW108cRNA为内参对照来确定Jurkat细胞诱导产生的IL-2 mRNA量为例。

材料与试剂

1. RNA提取所需试剂与材料

2. MMLV逆转录酶

3. 32 P末端标记引物（IL-2引物序列见第九章，放射性标记见第四章相应内容）

4. dNTP，Tag DNA聚合酶等

操作方法

1. 以标准方法从细胞株中分离总RNA；以适当的转录系统合成AW108cRNA，cRNA产物经oligo(dT)柱纯化，测其260nmOD值，并计算含量；

2. 用10μl逆转录反应系统，加入1μg细胞总RNA，1.77×102 ～1.77×107 个分子的AW108 RNA，1×PCR缓冲液，1mmol/L DTT，0.5mmol/L 4种dNTP，10U RNA酶抑制剂，0.1μg 0ligo(dT)引物，1μl MMLV逆转录酶。于37℃保温60min，95℃加热5min 使酶失活,并立即置冰浴冷却；

3. 将逆转录产物稀释3倍，混匀，加入50μmol/L的4种dNTP，上游和下游两种引物各5pmol/L，1×106 cpm 32 P末端标记引物，1U Taq DNA聚合酶，反应总体积为50μl，加50μl石蜡油，共进行25个循环，95℃×30s，95℃～55℃斜坡，2min，55℃30s，55℃～72℃斜坡，30s，72℃×10min。

4. 取PCR产物5～10μl于10% PAGE胶中进行电泳分析,缓冲液为TBE。用EB染色，然后照相，切取合适的条带，用液闪计数仪测定放射强度。

5. 定量从凝胶中回收的扩增片段，用放射性对模板浓度作图，用标准曲线来定量特异mRNA，见图