竞争定量PCR

竞争定量PCR是先构建一个与靶基因相同的扩增效率和引物结合位点仅探针结合位点不同的内标，在同一反应管内，靶基因和内标物和引物（primer）竞争性结合，进行同步扩增，由于竞争作用，当一种模板量逐渐增加时，另一种模板的扩增产物相对逐渐减少，但两种扩增产物的比值和两种初始状态时模板分子数的比值是一致的。根据标准品的准确含量制作标准曲线，从而进行准确核酸定量。由于内标品构建中特别要求是Ev与靶基因扩增效率一致，如果靶基因序列和内标相同，那么扩增过程中两者的实际扩增效率就接近一致，就可以对靶基因进行绝对定量，即确定样品中靶基因准确分子数，否则只能相对定量，即确定样本间靶基因分子数的差异，总体上说，加入内标物，消除PCR扩增过程中于反应管和反应管间以及标本之间存在差异。因此，内标法是目前PCR定量方法中最准确的方法，但构建内标物是建立本方法的关键。
构建内标物的基本原则是内标物具有靶基因的相同扩增条件和相同扩增效率。和可区别于靶基因探针结合位点与不干扰靶基因的扩增。因此，理想的内标物应具备与靶基因序列待分析序列相同的引物结合位点，相似的或相同大小、相似的碱基排列顺序。目前，内标法构建的方法有：靶基因扩增产物的突变；限制性片段的插入或缺失；含靶基因引物结合位点的非同源性DNA序列等，其中通过PCR方法构建的探针结合位点核苷酸直接突变构建的内标物是目前应用最多、最方便的方法。

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