细胞冻存与复苏技术（一）

概述

细胞培养技术自1907年开创以来，历经一个世纪现已成为自然科学领域不可缺少的研究方法之一。在细胞培养技术广泛用于科学研究领域的令天，细胞株的冷冻保存和解冻复苏这一基础技术日益得到重视。

低温保存是活体组织保存最常用的方法之一。冷冻保存一般是指在0～196℃进行保存，就是将体外培养物悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度，并在此温度下对其长期保存的过程。主要有-20～40℃ 冰箱保存、-60～80℃深低温冰箱和液氮（-196℃）超低温保存等。

应用方向

1. 医学方面

近年来干细胞的研究越来越被人们关注，由于它是一种具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，可分化为多种功能细胞。

根据发育阶段和取材来源，干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞两大类。骨髓和脐血是成体干细胞的主要来源。

骨髓干细胞在骨髓中含量极少，约占骨髓有核细胞的十万分之一，所以要在临床上广泛应用首先必须具备先进的冻存与复苏技术。

而干细胞研究的深入将解决包括癌症等一系列为人们所知的“绝症”。而“冬眠”技术对医学的发展有着里程碑式的意义。

2. 生物学方面

细胞冻存技术是生物学保存物种的重要手段。在环境遭到史无前例的破坏动物、植被随时可能面临灭绝危险的今天，更是尤为关键，虽然不是治本的方法，但至少可以尽可能的留下那些曾经存在的生命痕迹。

发展历史

1. 1776年，Spallanzani最早发表了“冷”处理对“细胞”生命活动影响的报道。

2. 十九世纪中后叶，许多早期的工作者（Prevost，1840；de Quatrefages，1853；Mantegazza，1866；Scheuk，1870）重复研究了低温处理对精子活动的影响，得出了和Spallanzani相似的结论。即“冷不能杀死精子”。

3. 1900年前后，科学家基本上肯定了生物成份能够在零下温度储存的事实。

4. 二十世纪50年代，Luyet等多位学者发现了电解质浓度对储存细胞的损伤作用，他们的基本结论是。电解质浓度增大是造成储存细胞损伤的主要原因。

5. 1972年，Mazur等首先根据中国仓鼠组织培养细胞的低温保存实验数据分析，提出关于冷冻损伤的两因素假说目，即冰晶损伤和溶液损伤假说。

这个假说认为随着温度的下降，细胞内外的水分结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏并引起细胞死亡。这种因细胞内部结冰而致的细胞损伤即就是冰晶损伤（Intracellular ice damage）。冰晶损伤是由冷却速度过快造成，冷却速度越快，冰晶损伤越大。

同时随着温度的下降，细胞外部的水分会先结冰，从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高，细胞膜上的脂质会因长时问暴露在高溶质的溶液中而受到损坏，细胞发生渗漏，导致在复温时大量水分渗入细胞内造成细胞死亡。这种因保存溶液溶质浓度增高而致的细胞损伤被称为溶液损伤（Solution damage）。溶液损伤是由冷却速度过慢，使细胞在高浓度的溶液中暴露的时间过长而造成，冷却速度越慢，此损伤越严重。

主要技术

冻存技术

1. 液氮法

目前，细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细胞外，减少胞内形成冰结晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。

常用的细胞冷冻贮存器为液氮贮存器，规格有35L3和50L3两种。

细胞冻存时常备的材料有：0.25%胰蛋白酶，含10%～20%的血清培养液，DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油（121℃蒸气高压消毒），2ml安瓿（或专用细胞冻存管）、吸管、离心管、喷灯、纱布袋（或冻存管架）等。

主要操作步骤为：

（1）选择处于对数生长期的细胞，在冻存前一天最好换液。将多个培养瓶中的细胞培养液去掉，用0.25% 胰蛋白酶消化。适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。悬浮生产细胞则不要消化处理。然后将细胞收集于离心管中离心（1000r/min，10分钟）。

（2）去上清液，加入含20%小牛血清的完全培养基，于4℃预冷15分钟后，逐滴加入已无菌的DMSO或甘油，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，细胞浓度为3×106～1×107/ml之间。

（3）将上述细胞分装于安瓿或专用冷冻塑料管中，安瓿装1～1.5ml在火焰喷灯上封口，封口处要完全封闭，圆滑无勾。冷冻管要将盖子盖紧，并标记好细胞名称和冻存日期，同时作好登记（日期、细胞种类及代次、冻存支数）。

（4）将装好细胞的安瓿或冻存管装入沙布袋内；置于液氮容器颈口处存放过夜，次日转入液氮中。采用控制降温速度的方法也可采用下列步骤：先将安瓿置入4℃冰箱中2～3小时，再移至冰箱冷冻室内3～4小时（此步可省略），再吊入液氮容器颈气态部分存放2小时，最后沉入液氮中。

2. 分布降温法

细胞系冻存程序：

1) 单层细胞的消化。将经24～48小时培养已长成单层的传代细胞培养物弃去生长液，加适量ATV，1～2分钟后倒弃ATV，再加入少量ATV液，经0.5～1分钟倒去ATV，室温或37oC温箱作用2～3分钟，视细胞解离情况，拍打细胞培养瓶。使单层细胞完全解离。SP2/0瘤细胞，待生长好后用吸管吹打，再经1000转/分离心l0分钟。

2) 离心洗涤：向培养瓶内加5～10m1预冷的MEM使细胞悬浮，再将其吸出置灭菌离心管中，以1000rpm 离心8～10分钟后弃去上清液。

3) 细胞悬液的制备：向离心管内逐滴缓慢加入预冷的冻存保护液，使细胞浓度为150~400万/ml，然后迅速分装于安瓿瓶中，每瓶加量为lml。

4) 致冷冻结：将安瓿瓶放入带有棉垫的纸盒或塑料盒内，直立置不同条件下致冷冻结果保存：

a. 4℃两小时后移至-20℃作用2小时，再移入-40℃4小时后在-70℃下24小时投入液氮。

b. -20℃4小时后移至-40℃，经4小时移人-70℃冰箱24小时，投入液氮。

c. -40℃4小时后移入-70℃24小时后投入液氮。

d. -20℃4小时后移入-70℃经24小时后投入液氮中。

e. -70℃24小时后投入液氮中。

5) 液氮中保存：将冻结后的安瓿装入预冷的小布袋中，投入液氮。为防止安瓿漂浮，可预先在小布袋中加入几块小卵石。

3. 玻璃化法

玻璃化保存（Vitrification）是一种超速冷冻方法。它是以极快的速度冷冻细胞，使细胞内外的游离水迅速形成玻璃样物质，而不形成冰晶。这种保存方法既避免了由于慢速降温时导致的盐浓度升高，又防止了由于冰晶形成造成的物理损伤，可获得较高存活率。

玻璃化首先由Luyet在1937年提出，他认为生命是生物活体系统的原子或其他结构元的一种特殊排列．并且轻微的排列位置扰动就会破坏平衡从而导致死亡，而结冰时的驱动力会破坏这种特殊的排列，这就是冰冻死亡的原因。玻璃化比冻结固化方法引起的结构变化要小，因而是一种较理想的低温保存途径。

1981年，Fahy首先明确提出，用高浓度的低温保护剂溶液，可在较慢地冷却速率以及高压条件下实现完全的玻璃化，以后又发展了一些所谓“玻璃化溶液”，使细胞、组织乃至器官等范围广泛的生物系统玻璃化低温保存成为可能。

1985年，Rail和Fahy用这种玻璃化溶液使鼠胚胎玻璃化保存获得成功，是这种技术走向实用化的首次突破。