mRNA纯化

mRNA的分离方法较多，其中以寡聚（dT）-纤维素柱层析法最为有效，已成为常规方法。此法利用mRNA 3‘末端含有Poly（A+）的特点，在RNA流经寡聚（dT）纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被洗脱，经过两次寡聚（dT）纤维柱后，即可得到较高纯度的mRNA。

寡聚（dT）纤维素柱纯化mRNA：

试剂试剂：

1、3M醋酸钠（pH 5.2）

2、0.1M NaOH

3、1×上样缓冲液：20mM Tris-HCl（pH 7.6）；0.5M NaCl;1M EDTA（pH 8.0）；0.1%SLS（十二烷基氨酸钠。配制时可先配制Tris-HCl（pH 7.6）、NaCl、EDTA（pH 8.0）的母液，经高压消毒后按各成分确切含量，经混合后再高压消毒，冷却至65℃时，加入经65℃温育（30min）的10%SLS至终浓度为0.1%.

4、洗脱缓冲液：10mM Tris-HCl（pH 7.6）；1mM EDTA（pH 8.0）；0.05% SDS

5、无水乙醇、70%乙醇

6、DEPC

试验步骤：

1、将0.5-1.0g寡聚（dT）-纤维悬浮于0.1M的NaOH溶液中。

2、用DEPC处理的1ml注射器或适当的吸管，将寡聚（dT）-纤维素装柱0.5-1ml,用3倍柱床体积的DEPC H2O洗柱。

3、使用1×上样缓冲液洗柱，直至洗出液pH值小于8.0.

4、将RNA溶解于DEPC H2O中，在65℃中温育10min左右，冷却至室温后加入等体2×上样缓冲液，混匀后上柱，立即收集流出液。当RNA上样液全部进入柱床后，再用1×上样缓冲液洗柱，继续收集流出液。

5、将所有流出液于65℃加热5min,冷却至室温后再次上柱，收集流出液。

6、用5-10倍柱床体积的1×上样缓冲液洗柱，每管1ml分部收集，OD260测定RNA含量。前部分收集管中流出液的OD260值很高，其内含物为无Poly（A）尾的RNA.后部分收集管中流出液的OD260值很低或无吸收。

7、用2-3倍柱容积的洗脱缓冲液洗脱Poly（A+）RNA,分部收集，每部分为1/3-1/2柱体积。

8、OD260测定Poly（A+）RNA分布，合并含Poly（A+）RNA的收集管，加入1/10体积3M NaAc（pH5.2）、2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀，-20℃放置30min.

9、4℃离心，10000g×15min，小心吸弃上清。用70%乙醇洗涤沉淀。[注意：此时Poly（A+）RNA的沉淀往往看不到]。4℃离心，10000g×5min，弃上清，室温晾干。

10、用适量的DEPC H2O溶解RNA.

注意事项：

1、整个实验过程必须防止Rnase的污染。

2、步骤4中将RNA溶液置65℃中温育然后冷却至室温再上样的目的有两个，一个是破坏RNA的二级结构，尤其是mRNA Poly（A+）尾处的二级结构，使Poly（A+）尾充分暴露，从而提高Poly（A+）RNA的回收率；另一个目的是能解离mRNA与rRNA的结合，否则会导致rRNA的污染。所以此步骤不能省略。

3、十二烷基肌氨酸钠盐在18℃以下溶解度下降，会阻碍柱内液体流动，若室温低于18℃最好用LiCl替代NaCl.

4、寡聚（dT）-纤维素柱可在4℃贮存，反复使用。每次使用前应该依次用NaOH、灭菌 ddH2O、上样缓冲液洗柱。

5、一般而言，107哺乳动物培养细胞能提取1-5μg Poly（A+）RNA,约相当于上柱总RNA量的1%-2%.