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实时定量PCR完全手册

方法简介
所谓的实时荧光定量 PCR 就是 通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。

RT-qPCR是由三个步骤组成
1. 反转录:依赖反转录酶将RNA反转录成cDNDA;
2. 扩增:用PCR的方法扩增cDNA;
3. 检测:实时检测和定量扩增的产物.

RT-qRCR影响分析可靠性关键点(Key porint)
1. 分析结果依赖于模板的数量、质量以及合理的检测方法设计
2. 反转录反应的非标准化影响试验的稳定性
3. 数据分析应该高度客观，如果不合理的分析，从分析结果中会得到混淆的错误结果，因此通过对RT-qPCR的每一组分进行质量评价以达到最小化变异性，最大化可重复性，而且还需要沿用一个通用的数据分析的指南。对基因表达分析的标准化的需要是与人类临床诊断分析相适应的。

存在的问题
由于各个学术团体和科研机构使用不同的操作流程，必然导致大家使用不同定量的来源物以及数据分析：
1. 新鲜、冰冻、甲醛固定的样品
2. 整个组织样本，显微切割样本，单个细胞，组培细胞
3. 总RNA或者mRNA
4. RNA反转录成cDNA的不同的引发策略
5. 不同的酶以及酶的不同组合
6. 变异系数、灵敏度
7. 多类型的检测化学方法，反应的条件，热循环仪的分析以及汇报方式。
8. 每一步骤缺乏标准化分析流程造成了在样品的处理，内参的使用，归一化的方法，质量控制等等因素严重影响RT-qPCR的可信度，重复性。

RNA 质量评价
现在RNA 定量的程序很多。最近EMBO qPCR course 比较了用Ribogreen, Agilent BioAnalyser, spectrophotometer,Nanodrop and the BioRad Experion 来定量同样的样品。结果显示没有哪两种方法得到同样的分析数据。所以用不同的方法进行定量是不明智的。因此，我们需要用统一套定量分析方法来完成所有RNA样品的评价

RNA 质量
RNA 质量主要包括RNA的纯度（没有蛋白质和DNA的污染）以及完整性。传统的RNA质量的评价通过分析A260/A280的比值或者对琼脂糖凝胶电泳rRNA的条带的分析。Agilent Bioanalyser/BioRad Experion 微流体毛细电泳系统也是一种较新的分析方法。Agilent的2100也是一种十分好的分析RNA质量的方法，它通过分析18S以及28S rRNA的分析图谱，通过图谱来反应RNA的量和完整性，其完整性通过完整性系数（RIN）来反应。样品的RINs在10-4之间。10代表完整的RNA，4代表没有完整的rRNA带。

由于以上的方法并非100％准确定反应mRNA的完整性，因为他们只是反应rRNA的量来间接测定mRNA的完整性。这里推荐一种方法：采用GAPDH的3’：5’分析法。

我们使用oligo dT进行逆转录，然后对逆转录的cDNA用multiplex荧光定量评价。设计三个taqman探针来定量三种相同大小的扩增产物。探针设计的位点分别位于3’;5’以及中部。扩增产物的之间的比值反应RNA的完整性。如果3’;5’的比值在1,反应较高度完整性，如果高于5说明降解。

QRT-PCR 抑制物的组成
QRT-PCR抑制物严重减少了PCR的灵敏度以及热动力学反应,高度的抑制还导致假阴性的结果。
抑制物的来源：生物样品的核酸抽提以及共沉淀中的混合物，盐离子，尿素，血红素，heparin以及IgG.
是否有抑制物的评价体系：
1. 通过对目的样品进行梯度稀释进行PCR扩增效率的检测
2. 通过内部扩增对照来反应样品处理过程中样本的情况
3. 用细菌基因组检测临床样品的抑制
4. 通过标准人工合成的扩增进行RT-PCR来反应目标检测物的抑制情况

反转录反应系统
1. RT和PCR单一酶系统
2. RT和PCR分离的酶系统
3. RNA逆转录引物的选择
引物主要有三种：
1. 随机引物：随机引物，特别是6nt引物对所有的靶位点不产生十分稳定一致的结果，建议使用15nt的随机引物
2. oligo-dT：只能用于mRNA完整的样品，特别有polyA .而且对于一些特殊的变异体以及较长的3’UTR的区域比较困难
3. 特异引物：最特异最灵敏的方法。特别RNA量足够情况下建议使用此法。

PCR 优化
PCR优化主要有：
1. 引物的浓度
2. 建议使用SYBR Green I和EvaGreen 进行扩增和溶解曲线的测试

笔者建议的操作流程
I．靶的选择和试验设计
1. 针对目的基因序列选择合适的扩增片断
查看以下三个网站是否有合适的已经证实的QRT-PCR的扩增引物,探针以及反应条件.
RTPrimerDB
PrimerBank
Real Time PCR Primer Sets
如果没有合适的或者已经证实的可以提供参考,以下的设计方案仅供参考:

A. 最广泛使用的商业化的软件Beacon Designer

B. DIY的软件Primer Express

C. 如果Beacon Designer 无法得到您说需要的结果,或者获得到设计方案的备选数目不够的话,可以选择Sigma-Genosys

D. 一个免费的基于网页构架的引物和探针设计程序
您可以挑选其中的4-6对引物进行试验,选择引物的扩增效率和灵敏度高的.这个软件可以直接与NCBI的网站进行比对,并且用NCBI的ePCR进行虚拟的电子PCR

引物设计简介
DNA引物长度:15-25 个碱基
GC含量:50%左右
如果引物的与AT区域富集结合,可以考虑用LNA替换几个碱基,较少引物的长度以及避免引物次级结构和3’端二聚体的影响.由于引物和模板和探针与靶点之间的分之间的相互竞争,分之内杂交,倒转重复等等会引起引物的引发探针对结合效率达降低,因此我们选择引物二聚体的△G为负值,即:<10 kcal/mol.没有连续的G/C.

引物探针的保存一般遵循以下原则:

1.正向和反向引物保存在-20度, 浓度为10mM 或者10×工作浓度.探针应该避光保存，贮存在-70度,最好以冻干粉状态，工作浓度的液体保存一般两周左右。

2. 输入靶序列，用BLASTn进行比对

3. 检查比对序列的多态性以及可能的错误避免这些区域来进行引物和探针设计

4. 在靶序列中避免直接待重复区，在重复区进行杂交容易使得引物非获得产物性结合，降低DNA的扩增效率以及减少分析的灵敏度。

5. 考虑到潜在的剪接变异体以及合适的所需要的获得到靶，通过生物信息学分析内含子以及外显子的边界，主要通过cDNA和基因组序列比对来确定。一般都设计跨最长内含子区，这样减少了扩增子受到基因组DNA的污染的影响。

这是十分有必要的，特别当用基因组DNA做归一化处理以及靶向某一特异的剪接变异体。最经济的做法是让下游引物跨越剪接接头，这样允许使用一条探针检测可能剪接变异体.然后如果在有效性和灵敏度无法保证情况下，可以使用跨越单一外显子的设计方案。我们还是建议试验者用DnaseI处理样品，除去gDNA的污染。

6. 在RT步骤时，用工具检测在特定温度下靶序列的折叠情况，避免一些高度次级结构的区域，那些区域探针和引物结合效率较低

7. 尽可能用60-150bp的扩增产物，GC含量在60％或者稍小来确定高效的变性，更高度反应效率。GC含量高度序列容易产生非特异性的反应，短序列扩增是的扩增时间缩短gDNA污染可能性减少。短的序列容易人工合成，用来做扩增多标准曲线。用oligodT进行逆转录最好设计扩增子位于靠近模板的3’区域

基因沉默编辑