植物体内可溶性蛋白质含量的测定(考马斯亮蓝法和LOWRY法)

实验 植物体内可溶性蛋白质含量的测定

植物体内的可溶性蛋白质大多数是参与各种代谢的酶类，测其含量是了解植物体总代谢的一个重要指标。在研究每一种酶的作用时，常以比活（酶活力单位／ mg 蛋白）表示酶活力大小及酶制剂纯度。因此，测定植物体内可溶性蛋白质是研究酶活的一个重要项目。常用测定方法有 Lowry 法和考马斯亮蓝 G-250 染料结合法。本实验将分别介绍这两种方法。

一、考马斯亮蓝法

【原理】

考马斯亮蓝 G-250 测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝 G-250 在游离态下呈红色，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在 465nm ，后者在 595nm 。在一定蛋白质浓度范围内（ 0 ～ 100 μ g/ml ），蛋白质－色素结合物在 595nm 波长下的光吸收与蛋白质含量成正比。故可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝 G-250 结合在 2min 左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下 1h 内保持稳定。该反应非常灵敏，可测微克级蛋白质含量，所以是一种比较好的蛋白质定量法。

【仪器与用具】

分光光度计， 10ml 量筒 1 支；研体； 10ml 容量瓶 1 支； 1ml 刻度吸管 3 支； 10ml 具塞刻度试管 14 支。

【试剂】

（ 1 ）牛血清白蛋白 配成 1000 μ g/ml 和 100 μ g/ml ；

（ 2 ）考马斯亮蓝 G-250 ：称取 100mg 考马斯亮蓝 G-250 溶于 50ml 90% 乙醇中，加入 85% （ W/V ）磷酸 100ml ，最后用蒸馏水定容至 1000ml 。此溶液在常温下可放置一个月；

（ 3 ） 90% 乙醇；（ 4 ）磷酸（ 85% ， W/V ）。

【方法】

1. 标准曲线的绘制

（ 1 ） 0 ～ 100 μ g/ml 标准曲线的制作 取 6 支试管，按表 28-1 数据配制 0 ～ 100 μ g/ml 血清白蛋白液各 1ml 。准确吸取所配各管溶液 0.1ml ，分别放入 10ml 具塞试管中，加入 5ml 考马斯亮蓝 G-250 试剂，盖塞，反转混合数次，放置 2min 后，在 595nm 下比色，绘制标准曲线。

表 28-1 配制 0 ～ 100 μ g/ml 血清白蛋白液

（ 2 ） 0 ～ 1000 μ g/ml 标准曲线的制作 另取 6 支试管，按表 28-2 数据配制 0 ～ 1000 μ g/ml 牛血清白蛋白溶液各 1ml 。与步骤（ 1 ）操作相同，绘出 0 ～ 1000 μ g/ml 的标准曲线。

表 28-2 配制 0 ～ 1000 μ g/ml 血清蛋白血液

2. 样品提取液中蛋白质浓度的测定 吸取样品提取液 0.1ml （样品提取见各酶活测定），放入具塞刻度试管中（设两个重复管），加入 5ml 考马斯亮蓝 G-250 试剂，充分混合，放置 2min 后在 595nm 下比色，记录吸光度值，通过标准曲线查得蛋白质含量。

3. 结果计算

样品蛋白质含量（ mg/g 鲜重） =

式中 C －查标准曲线所得每管蛋白质含量（ mg ）；

V －提取液总体积（ ml ）；

a －测定所取提取液体积（ ml ）；

W －取样量（ g ）。

二、 LOWRY 法

【 原理】

Lowry 法是双缩脲法和福林酚法的结合与发展，其原理是：蛋白质溶液用碱性铜溶液处理，形成铜 - 蛋白质的络合盐，再加入酚试剂后，除使肽链中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等显色外，还使双缩脲法中肽键、碱性铜的显色效果更强烈。因此， Lowry 法的显色效果比单独使用酚试剂强烈 3 ～ 15 倍，为双缩脲法 100 倍。由于肽键显色效果增强，从而减小了因蛋白质种类引起的偏差。

Lowry 法的试剂由两部分组成，试剂甲相当于双缩脲试剂（碱性铜溶液），可与蛋白质中的肽键起显色反应；试剂乙为磷钨酸和磷钼酸混合液，在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原生成钼蓝和钨蓝混合物而呈蓝色反应，因此蛋白质的酪氨酸和胱氨酸等可显色，颜色深浅与蛋白质含量成正比。

【仪器与用具】

试管若干；刻度吸管 0.5ml ， 1ml ， 10ml ；定量加样器；圆底烧瓶；冷凝管一套（带橡胶管）；微量滴定管；小烧杯；微量进样器 50 μ l ；分光光度计。

【试剂】

Na2 WO4 ・ 2H2 O ； Na2 MoO4 ・ 2H2 O ； 85% H3 PO4 ；浓 HCl ； Li2 SO4 ・ H2 O ；溴水；酚酞指示剂； Na2 CO3 ； NaOH ； CuSO4 ・ 5H2 O ；酒石酸钾钠；

牛血清白蛋白：用水配成 250mg/ml 。

【方法】

1. 酚试剂的制备

（ 1 ）取 Na2 WO4 ・ 2H2 O100g， Na2 MoO4 ・ 2H2 O25g及蒸馏水 700ml 于 1500ml 的圆底烧瓶中，之后加入 85% H3 PO4 50ml ，浓 HCl 100ml 。安上回流冷却装置（使用磨口接头。用软木塞或橡皮塞时，必须用锡泊包起来），使其慢慢沸腾 10h 。冷却后加入 Li2 SO4 ・ H2 O150g，水 50ml ，浓 HCl 100ml 安上回流冷却装置，开口加热煮沸 15min ，以逐出过量的溴。冷却后稀释至 100ml ，并过滤入棕色瓶中，密闭于冰箱中保存。

使用时用标准 NaOH 溶液滴定，以酚酞为指示剂。滴定终点由蓝变灰。滴定后算出酸浓度，用时适量稀释，使最后浓度为 1 mol/L H ＋ ，此为 Folin- 酚试剂乙液。

（ 2 ）首先配制① 4% Na2 CO3 溶液；② 0.2 mol/L NaOH 溶液；③ 1% CuSO4 溶液；④ 2% 酒后石酸钾钠溶液；使用前①与②等体积混合配成 Na2 CO3 -NaOH 溶液；将③与④等体积混合配成硫酸铜一酒石酸钾钠溶液。然后将这两个溶液按 50 � 1 混合；配成 Folin- 酚试剂甲液。此试剂只能用一天。

2. 标准曲线的绘制

（ 1 ）取 7 只试管编号 , 分别加 0ml ， 0.1ml ， 0.2ml ， 0.4ml ， O.6ml ， 0.8ml ， 1.0ml 标准蛋白质溶液，用水补到 1ml ，便成为每管含蛋白为 0mg ， 25mg ， 50mg ， 100mg ， 150mg ， 200mg ， 250mg 标准系列（必要时可做重复）。

（ 2 ）加 5ml 试剂甲，混匀，于30 ℃放置 10min 。

（ 3 ）喷射加入 0.5ml 试剂乙，立即振荡混匀，在30 ℃下保温 30min 。

（ 4 ）准确到 30 分后，以不加标准蛋白的管为空白，在 500nm 波长下比色测定吸光度值。

（ 5 ）以蛋白浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

3. 样品测定

（ 1 ）取 50 μ l 样液加入试管中，（样液提取一般按0.1g鲜样 /ml 比例，提取方法见各酶活测定）加蒸馏水补至 1ml ，然后重复步骤 2 的（ 2 ），（ 3 ），（ 4 ），以空白为参比，测吸光度值。

（ 2 ）根据吸光度值，查标准曲线求得蛋白质含量。

4. 结果计算

蛋白质含量（ mg/g 鲜重）＝

式中 C －查标准曲线得样品测定管中蛋白质含量（ mg ）；

V －提取液总量（ ml ）；

a －测定时取样液量（ ml ）；

W －取样量（ g ）。

【注意事项】

1.Folin 试剂乙只在酸性条件稳定，故当其加到碱性的铜 - 蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸 - 磷钨酸试剂被破坏前，还原反应即能发生。

2. 为了保证反应进行完全，反应在 25 ～30 ℃水浴中进行，反应 30min 后准时比色。

3. 还原物质干扰本实验。

【方法评述】

上述两种方法均是灵敏度为微克级的高灵敏度定量测定蛋白质方法，前者稳定，后者简便；二者均优于现有的其它方法。二者的缺点是： Lowry 法受植物体内存在的酚类物质干扰；考马斯亮蓝法在蛋白质含量很高时线性关系稍偏低，且不同蛋白质与色素结合状况有差异。