肝组织中核酸的分离与鉴定
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一、肝组织中 DNA 的分离与鉴定
【 实验目的】
1 ．掌握 DNA 分离纯化的原理和方法。
2 ．熟悉台式离心机 的使用。
3. 掌握 DNA 定量技术。
【 实验原理】
细胞内的核酸多以核蛋白的形式存在，其中脱氧核糖核蛋白主要存在于细胞核 中，核糖核蛋白主要存在于细胞质中。这两类核蛋白在 0.14mol ／ L 氯化钠溶液中的溶解度相差很大，核糖核蛋白在此溶液中具有很高的溶解度，脱氧核糖核蛋白的溶解度却相当低。制成肝匀浆后，用 0 ． 14mol ／ L 氯化钠溶液抽提，可将两种核蛋白分离。分离过程中加入少量柠檬酸钠，可抑制脱氧核糖核酸酶对 DNA 的水解作用。
SDS( 十二烷基硫酸钠 ) 能使脱氧核糖核蛋白产生解聚作用，在含有脱氧核糖核蛋白的溶液中加入 SDS ， DNA 即与蛋白质分离开，用氯仿将蛋白质沉淀除去，而 DNA 溶解于水相，最后用冷乙醇将 DNA 析出，而获得纯化的 DNA 。在氯仿中加入少量异戊醇能减少操作过程泡沫的产生，并有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白，下层有机溶剂相维持稳定。 DNA 和 RNA 在波长 260nm 处有很高的吸收峰值，蛋白质则在 280nm 处有很高的吸收峰值。
利用这个原理，测定纯化样品在 260nm 和 280nm 处的吸光度，可以推算出样品中 DNA 的浓度，并判断其纯度。在标准条件下，当 A260 ＝ 1 时，样品中双链 DNA 浓度为 50 μg/ml ，单链 DNA 浓度为 40 μg/ml 。纯净的 DNA 样品 A260/A280 的比值约为 1.8 ，样品中含有蛋白质或其它杂质，会使 A260/A280 的比值下降。
【 器材和试剂】
1. 器材 玻璃匀浆器、离心机 、试管、刻度吸管、紫外可见分光光度计
2. 试剂
1. 0.9 ％氯化钠溶液
2. 10 ％氯化钠溶液
3. 0.14 mol/L 氯化钠溶液 ( 含 0.01 mol/L 柠檬酸钠 ) ：称取氯化钠 8.182g 和柠檬酸钠 2H2O 2.941g ，用蒸馏水溶解并稀释至 1000m 1
4. 95 ％乙醇溶液 ( 冷藏 )
5. 5 ％十二烷基磺酸钠 (SDS) 溶液 : 称取 25 克 SDS 溶于 500m 1 45 ％乙醇
6. 氯仿 - 异戊醇混合液：氯仿 : 异戊醇 =24:1
7. 0.1 mol/L NaOH
【 操作步骤】
1 ．肝匀浆制备：新鲜猪肝，用 0.9 ％ NaCI 洗去血液，除去结缔组织，剪碎，称取 4g 肝组织，加 4ml 0.14mol ／ L NaCl 溶液，匀浆器中研磨，制成肝匀浆。
2 ．分离核蛋白：肝匀浆倒入试管中， 4000r/min 离心 5min ，上清弃去。沉淀加 2 m 1 0.14 mol/L NaCl 搅匀后再置匀浆器中研磨， 4000r/min 离心 5min ，上清弃去，沉淀重复上述操作，上清弃去，沉淀为 DNA- 蛋白质复合物。
3 ．沉淀中加 0.14mol/L NaCl 2.0ml ，搅匀，滴加 5 ％ SDS 2.0m1 ，边加边搅， 60 ℃ 水浴 10 min( 不停搅拌 ) ，冷至室温，均匀分成两管为 Bl 、 B2 。
4 ． B1 、 B2 管中各滴加氯仿 - 异戊醇液 4.0m 1( 边加边搅 ) ，搅至溶液颜色均匀， 3000r/min 离心 15min 。溶液分三层，上层液为水相 ( 含 DNA) ，中层为蛋白质沉淀，下层为有机相，吸取 B1 、 B2 上层液合倒于另一试管中。
5 ．上清液加 95 ％冷乙醇 4.0m 1 ，混匀 ( 颠倒混匀法 ) ， 3000r/min 离心 15min ，去上清液，沉淀为纯化 DNA 。
6 ． DNA 的溶解：沉淀中加入 0.1 mol/L NaOH 4.0ml ，搅拌溶解， 2000r/min 离心 10min ，上清液则为 DNA 水解液。
7 ． DNA 的测定：用 0.1mol/L NaOH 将样品稀释到一定浓度，以 0.1mol/L NaOH 调零，测定样品的 A260 和 A280 ，计算出每克肝组织中的 DNA 含量，并判断纯化 DNA 的纯度。
【 注意事项】
1 ．在制备肝匀浆时，应尽量在冰冷条件下进行，并尽快加入含 0.0l mol ／ L 柠檬酸钠的 0.14mol/L 氯化钠溶液，以抑制脱氧核糖核酸酶 ，防止 DNA 的分解，以提高核酸得量。
2 ．各步骤操作应力求准确，尽量减少中途核酸的丢失，保证定量测定的准确性。
3 ．稀释后应该尽量使样品 A260 和 A280 处于 0.1-0.7 的范围内。
二、肝组织中 RNA 的分离与鉴定
【 实验目的】
1 ．掌握 RNA 分离纯化的原理及操作方法
2 ．掌握 RNA 定量技术
【 实验原理】
根据前面所述， DNA 和 RNA 这两类核蛋白在 0.14mol ／ L 氯化钠溶液中的溶解度不同，制成肝匀浆后，用 0.14mol ／ L 氯化钠溶液抽提，可将两种核蛋白分离 。在含有核糖核蛋白的 0.14mol ／ L 氯化钠溶液中，调节 pH 至 4.2 ，使其达到等点电，核糖核蛋白即从溶液中沉淀出；用热的 10 ％氯化钠溶液抽提核糖核酸，最后用冷乙醇将核糖核酸钠析出，而获得纯化的 RNA 。
分离过程中注意 RNase 的活性，防止 RNA 的降解。 RNase 无处不在，且耐高温， RNA 的提取条件比 DNA 要严格得多，常采用 DEPC( 焦碳酸二乙酯 ) 来抑制 RNase 的活性。样品中 RNA 的浓度及纯度测定，与前相同，在此不再赘述，纯度较高的 RNA 样品， A260/A280=1.8 ～ 2.0 ，如果 A260/A280 ＜ 1.8, 说明样品中含有蛋白质等，可用苯酚 - 氯仿抽提除去。
【 器材和试剂】
1. 器材 玻璃匀浆器、离心机、紫外可见分光光度计、试管、刻度吸管
2. 试剂
(1) 0.9 ％氯化钠溶液
(2) 10 ％氯化钠溶液
(3) 0.14mol ／ L 氯化钠溶液 ( 含 0.01 mol ／ L 柠檬酸钠 ) ：称取氯化钠 8.182g 和柠檬酸钠 ·2H2O 2.941g ，用蒸馏水溶解并稀释至 1000m 1
(4) 10 ％乙酸溶液
(5) 95 ％乙醇溶液 ( 冷藏 )
(6) 0.1mol/L NaOH
【 操作步骤】
1 ．肝匀浆制备：新鲜猪肝，用 0.9 ％ NaCl 洗去血液，除去结缔组织，剪碎，称取 4g 肝组织，加 4m 1 0.14mol/L NaCl 溶液，匀浆器中研磨，制成肝匀浆。
2 ．分离核蛋白：肝匀浆倒入试管中， 4000r/min 离心 5min ，上清倒入另一试管中为 A 管。沉淀加 2m 1 0.14mol ／ L NaCI 搅匀后再置匀浆器中研磨， 4000r/min 离心 5min ，上清倒入 A 管，沉淀重复上述操作，上清并入 A 管，沉淀弃去。
3 ． A 管用 10 ％乙酸调 pH 至 4.2 ，混匀，静置 5min ， 4000r/min 离心 5min ，倾去上清，沉淀含核糖核蛋白。
4 ． A 管沉淀中加 3m 1 10 ％ NaCI ，搅匀， 100 ℃ 水浴 10min( 不断搅拌，防沸溢出 ) ，冷却， 4000r/min 离心 5min ，留上清液。
5 ． A 管上清液加 95 ％冷乙醇 5m 1 ，见乳白色核糖核酸钠沉淀，混匀放置 10min ， 4000r/min 离心 15min ，沉淀为纯化 RNA 。
6 ． RNA 的溶解：沉淀中加入 0.1 mol/L NaOH 4.0ml ，搅拌溶解， 2000r/min 离心 10min ，上清液则为 RNA 水解液。
7 ． RNA 的测定：用 0.1mol/L NaOH 将样品稀释到一定浓度，以 0.1mol/L NaOH 调零，测定样品的 A260 和 A280 ，计算出每克肝组织中的 RNA 含量，并判断纯化 RNA 的纯度。
【 注意事项】
1 ．在制备肝匀浆时 , 在进行。在冰浴中进行，全部操做过程注意抑制 RNase 活性。
2 ．各步骤操作应力求准确，尽量减少中途核酸的丢失，保证定量测定的准确性。
3 ．稀释后应该尽量使样品 A260 和 A280 处于 0.1-0.7 的范围内。
【 思考题】
1. 分离 RNA 时为何使用浓盐 ?
2. 如何判断所提取的 DNA 的纯度 ?
3. 分离纯化 DNA 时通常使用什么试剂
