胶体金免疫层析法检测乙型肝炎病毒表面抗原

关键词： 乙型肝炎病毒表面抗原；胶体金免疫层析法Gold-immunochromatography

【摘要】 目的建立一种简易快速、自测式胶体金免疫层析法(GICA)用于检测血清中乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)。方法采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒、标记乙型肝炎病毒表面抗体(抗HBs)，制成免疫层析检测试条。血清中HBsAg与测试条上金标记抗体结合后沿着硝酸纤维素膜移动，与膜上的固相抗体结合形成肉眼可见的红色线条。结果 gICA试条只与HBsAg有特异性反应，与乙型肝炎病毒核心抗原、e抗原等无交叉反应。检测中国药品生物制品检定所HBsAg标准品，灵敏度可达1 ng/ml.用GICA与酶免疫法比较检测了395份不同血清标本中HBsAg，两法符合率为99.0%。结论 GICA检测血清中的HBsAg特异性强、灵敏度高、简便快速，无需特殊仪器设备，有广泛应用价值。

assay for hepatitis B virus surface antigen Zhou Jiwen, Rong Guangya, Yang shouchen, et al. 302nd Hospital of PLA, Beijing 100039

【Abstract】Objective A sensitive, rapid, simple and selfperforming gold immunochromatography assay (GICA) was developed for hepatitis B virus surface antigen (HBsAg) in sera.MethodsColloidal golds were coupled with monoclonal anti-HBs to prepare an GICA apparatus. The gold-anti-HBs conjugate reacts with HBsAg in serum and migrates up the nitrocellose strip on which anti-HBs was immobilized,thus producing the detection reaction.Results 395 sera of patients and healthy people were detected for HBsAg by GICA and EIA.The corresponding rate of both tests was 99.0%。 The sensitivity of GICA was 1 ng/ml by detecting HBsAg panel from the National Institute for the Control of pharmaceutical and Biological Products.

Conclusion GICA is a sensitive, specific, simple and rapid assay for detecting HBsAg.

【Key words】 Hepatitis b virus surface antigen Colloidal gold Immunochromatography免疫层析技术是90年代初在免疫渗滤技术［1，2］的基础上建立的一种简易快速的免疫学检测技术，由Beggs等［3］最先用于人绒毛膜促性腺激素(HCG)的测定，后来由胶体金代替胶体硒用于乙型肝炎(以下简称乙肝)病毒表面抗原(HBsAg)等检测。

我们用胶体金标记单克隆乙肝病毒表面抗体(抗HBs)，制成检测HBsAg的胶体金免疫层析法(GICA)检测试条。用该法检测HBsAg，其灵敏度与酶免疫法(EIA)相近，并具有简便快速、特异性好、不需要仪器设备等优点。

一、材料与方法

（一）材料

1、氯金酸(HAuCl·Cl3·4H2O)：北京化学试剂厂产品。

2、抗HBs：单克隆抗HBs及羊抗HBs均为本实验室制备。

3、HBsAg灵敏度标准参比品：中国药品生物制品检定所产品。

4、HBsAg酶免疫诊断试剂盒：北京科卫临床诊断试剂厂产品。

5、血清标本：315份肝炎患者血清采自本院住院患者。其中乙型肝炎患者血清220份，甲型肝炎、戊型肝炎患者血清各30份，丙型肝炎患者血清35份。肝炎分型诊断依据1995年北京第5次传染病和寄生虫病学术会议修定的诊断标准；80份健康人血清为健康供血者待筛检血清。

（二）方法

1、胶体金-抗HBs结合物的制备：参照文献［4，5］并稍加改进。其步骤为：超纯水溶解氯金酸使其终浓度为0.01%。煮沸后每100 ml加入1%柠檬酸三钠水溶液1.5 ml，继续煮沸15分钟。待冷却后用0.2 mol/L K2CO3调至pH 8.2.快速搅拌下加入纯化的抗HBs igG 2 mg，并继续搅拌15分钟。

加入牛血清白蛋白240 mg，再搅拌5分钟，最后加入10% naCl水溶液使含NaCl浓度为1%，混匀。以2 000 r/min离心10分钟，弃沉淀，上清液以10000 r/min离心60分钟。小心吸去上清液，沉淀物即为初步纯化的金-抗HBs结合物。溶于贮存液中(0.02 mol/L，pH 7.4 Tris-HCl，含40 mg/100 ml分子量20 000的聚乙二醇，50%甘油，0.02% NaN3)，-20℃保存。

2、免疫层析测试条的制备：测试条由吸水纤维、硝酸纤维素膜和吸水滤纸三部分组成。吸水纤维部分点金-抗HBs结合物；硝酸纤维素膜上用0.02 mol/L，pH7.4 PBS稀释成100μg/ml的羊抗HBs(检测线)和羊抗鼠IgG(对照线)包被成两条约1 mm宽的线条，晾干后用含10%新生牛血清的PBS封闭。干燥后依次粘在白色塑料片(支持物)上，切成0.8 cm×8 cm的条，加干燥剂密封保存。

3、HBsAg检测：以新鲜血清为好。试管中加入0.1～0.2 ml血清，将测试条点有金标记抗体端插入血清内即可。结果判定：以测试条纤维素膜上出现两条红色线为HBsAg阳性；仅出现一条红色线(靠近吸水滤纸端，对照线)为阴性。如果无红色线条出现则视为试剂失效。结果确定时间：强阳性标本在2分钟内即可在检测线见到红色胶体金颗粒聚集；弱阳性标本(1～2 ng/ml)约需要20分钟确定结果。

二、结果

1、 GICA检测HBsAg的特异性：将试条分别与HBsAg、HBcAg和HBeAg反应，结果只与HBsAg有特异性反应，其余均呈阴性反应。

2、 灵敏度：用GICA试条检测检定所2 ng/ml、1 ng/ml的HBsAg灵敏度参比品，其灵敏度可达1 ng/ml.

3、 稳定性：将GICA试条于37℃温箱放置4天，做热稳定性试验，与放置4℃的试条对照检测HBsAg强阳性、弱阳性及阴性血清，结果无明显差别。

4、 395份血清HBsAg检测结果：用GICA试条检测了315份各型肝炎患者血清和80份健康人血清中HBsAg，结果见表1.220份乙型肝炎患者血清中HBsAg阳性率为77.7%。丙型肝炎患者血清有8.6%、戊型肝炎患者血清中有3.3%检出HBsAg，可能为合并感染。

30份甲型肝炎患者血清中无HBsAg阳性。这395份血清同时用EIA检测其HBsAg，比较两法检测HBsAg的一致性，结果有4份血清两法检测结果不符(表2)，符合率为99.0%。4份两法结果不符的血清中，有2份(乙肝组与健康人各1份)GICA呈弱阳性，而EIA阴性，但这2份血清EIA吸光度值均接近临界值。另2份(均为乙肝组血清)GICA阴性，EIA为HBsAg弱阳性。

表1 315份各型病毒性肝炎患者与80份健康人血清HBsAg检测结果

表2 GICA与EIA法检测395份血清HBsAg结果比较

三、讨论

目前检测HBsAg多采用EIA，由于其操作程序较为复杂，延时长，给实验室检测带来不便，为适应实验室检测工作需要而推出的EIA一步法，虽然简化了操作程序，缩短了检测时间，但却带来了个别强阳性标本出现假阴性的问题［6］。

胶体金免疫层析法检测HBs，用胶体金代替酶标记抗HBs，样品中HBsAg与金-抗HBs结合物结合后沿硝酸纤维素膜迁移，在包被有抗HBs处形成“抗HBs-HBsAg-金标抗体”夹心物而出现红色线。此法集免疫反应与色谱层析之特点，使待测样品的HBsAg与吸水纤维上的金标抗HBs不断结合，形成HBsAg-金标抗体复合物，再由层析作用持续通过硝酸纤维素膜，与膜上固相抗HBs结合。

由于是所有样品均经过较窄的纤维素膜的持续性反应，实际上对被测的物质起到了浓缩作用。从而使免疫层析法比原理相近的免疫渗滤法更为敏感。此法无须洗涤，大大减少了污染机会，不需要仪器设备，易于操作，整个检测过程在20分钟内即可完成。

我们用胶体金免疫层析法检测了395份不同血清中HBsAg，并与EIA进行比较。两种方法检测HBsAg的符合率为99.0%。GICA的灵敏度与EIA相近。可达1 ng/ml.试验结果表明，GICA检测血清标本中HBsAg具有特异性强、灵敏度高、稳定性好、简易快速、无须仪器设备等优点，有广泛应用价值。

四、参考文献

1 Valkirs GE, Barton R. Immuno concentration--a new format for solid-phase immunoassays.

clin Chem, 1985, 31:1427-1431.

2 Spielberg F, Kabeya CM, Ryder RW, et al. Field testing and comparative evaluation of rapid,

visually read screening assays for antibody to human immunodeficiency virus. lancet, 1989, 1:580-584.

3 Beggs M, Novotny M, Sampedro S, et al. A selfperforming chromatographic immunoassay

for the qualitative determination of human chorionic gonadotrophin (HCG) in urine and serum. Clin

chem, 1990, 36:1084-1085.

4 Mey JD. The preparation and use of gold probes. In: Polak JM, Noorden SV, ed. immunocytochemistry

modern methods and applications. Bristol : John Writht, 1986. 115-145.

5 李成文著。现代免疫化学技术。上海：上海科学技术出版社，1992.165-181.

6 杨守纯。提高病毒性肝炎感染标志检验水平的趋向。中华医学检验杂志，1995，18：5

本研究为全军“九五”指令性课题基金资助 (基金编号96L049)