SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法—蛋白质的分子量测定

【实验目的】

1.掌握SDS—聚丙烯酰胺电泳法的原理。

2.学会用此种方法测定蛋白质的分子量。

【实验原理】

SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。该法主要依据蛋白质的分子量对其进行分离。SDS与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其稳定地存在于一个广泛均一的溶液中。SDS—蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。

由于在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。SDS—PAGE因易于操作和广泛的用途，使它成为许多研究领域中一种重要的分析技术。

SDS是十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）的简称，它是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质），使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分子量。

【实验材料】

1.实验器材

微型凝胶电泳装置；电源（电压200V，电流500mA）；100℃沸水浴；Eppendorf管；微量注射器（50μl或100μl）；干胶器、真空泵或水泵；带盖的玻璃或塑料小容器；摇床。

2.实验试剂

⑴ 2mol/l Tris-HCl (pH8.8):取24.2g Tris, 加50ml蒸馏水，缓慢的加浓盐酸至pH8.8（约加4ml）；让溶液冷却至室温，pH将会升高，加蒸馏水至100ml。

⑵ 1mol/l Tris-HCl (pH8.8):取12.1g Tris, 加50ml蒸馏水，缓慢的加浓盐酸至pH6.8（约加8ml）；让溶液冷却至室温，pH将会升高，加蒸馏水至100ml。

⑶ 10% (w/v) SDS: 取10g的SDS，加蒸馏水至100ml。

⑷ 50% (v/v) 甘油: 取50ml 100%甘油，加入50ml蒸馏水。

⑸ 1% (w/v) 溴酚蓝:取100mg溴酚蓝，加蒸馏水至10ml，搅拌,直到完全溶解，过滤除去聚合的染料。

⑹ A液--丙烯酰胺储备液（配制含30% (w/v) 丙烯酰胺和0.8% (w/v) 甲叉双丙烯酰胺的溶液100ml）在通风柜中操作，取29.2g丙烯酰胺，0.8g甲叉双丙烯酰胺，加蒸馏水至100ml，缓慢搅拌直至丙烯酰胺粉末完全溶解，用石蜡膜封口，可在4℃存放数月。

⑺ B液--4×分离胶缓冲液：取75ml 2mol/l Tris-HCl (pH8.8)，加入4ml 10% SDS, 加21ml蒸馏水，混匀，可在4℃存放数月。

⑻ C液--4×浓缩胶缓冲液:取50ml 1mol/l Tris-HCl (pH6.8)，加入4ml 10% SDS, 加46ml蒸馏水，混匀，可在4℃存放数月。

⑼ 10%过硫酸铵：取0.5g过硫酸铵，加入5ml蒸馏水，可保存在密封的管内，于4℃存放数月。

⑽ 电泳缓冲液：取3g Tris，14.4g甘氨酸，1g SDS，加蒸馏水至1l, pH约为8.3, 也可配制成10×的储备液，在室温下长期保存。

⑾ 5×样品缓冲液：取0.6ml 1mol/l Tris-HCl (pH6.8)，加入2ml 10% SDS, 5ml 50%的甘油，0.5ml 2-巯基乙醇，1ml 1%溴酚蓝，0.9ml的蒸馏水混匀，可在4℃保存数周，或在-20℃保存数月。

⑿ 考马斯亮蓝染液：1.0g 考马斯亮蓝R-250，加入450ml甲醇，450ml蒸馏水及100ml冰醋酸即成。

⒀ 考马斯亮蓝脱色液：将100ml甲醇，100ml冰醋酸，800ml蒸馏水混匀备用。