蛋白质的分子量测定-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法

目的要求

• 学会SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法原理。

  
  

• 掌握用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量的操作技术。

实验原理

SDS是十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）的简称，它是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4g SDS/1g蛋白质）。

使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质原有的电荷差别。这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分子量。

试剂和器材

一、试剂

30％分离胶贮存液：30g Acr,0.8g Bis, 用无离子水溶解后定容至100mL,不溶物过滤去除后置棕色瓶贮于冰箱。

10％浓缩胶贮存液：10g Acr,0.5g Bis, 用无离子水溶解后定容至100mL,不溶物过滤去除后置棕色瓶贮于冰箱。

分离胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液 PH8.9）:取1mol/L盐酸48mL，Tris 36.3g,用无离子水溶解后定容至100mL。

浓缩胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液 PH6.7）:取1mol/L盐酸48mL, Tris 5.98g,用无离子水溶解后定容至100mL。

电泳缓冲液（Tris-甘氨酸缓冲液PH8.3）:称取Tris 6.0g, 甘氨酸28.8g, SDS 1.0g, 用无离子水溶解后定容至1L。

样品溶解液：取SDS 100mg，巯基乙醇0.1mL，甘油1mL，溴酚蓝2mg，0.2mol/L，pH7.2磷酸缓冲液0.5mL，加重蒸水至10mL（遇液体样品浓度增加一倍配制）。用来溶解标准蛋白质及待测固体

染色液：0.25g考马斯亮蓝R-250，加入454mL 50%甲醇溶液和46mL冰乙酸即可。

脱色液：75mL冰乙酸，875mL水与50mL甲醇混匀。

10%过硫酸铵溶液；10％SDS溶液；1％TEMED。

二、材料

标准蛋白：溶菌酶（Mr 14 300）、胰凝乳蛋白酶原(Mr 25 000)、胃蛋白酶（Mr 35 000）、卵清蛋白（Mr 43 000）、血清白蛋白（Mr 67 000）等。按每种蛋白0.5-1mg/mL配制。可配成单一蛋白质标准液，也可配成混合蛋白质标准液。

二、器材

DYCZ-24D型垂直板电泳槽；移液管1 mL（′ 3），5 mL（′ 4），0.5mL（′ 1），0.1mL（′ 2）；烧杯100mL（′ 2）；细长头的吸管；微量注射器。

操作方法

一、 安装垂直板电泳槽

1. 将密封用硅胶框放在平玻璃上，然后将凹型玻璃与平玻璃重叠；

2．用手将两块玻璃板夹住放入电泳槽内，玻璃室凹面朝外，插入斜插板；

3．用蒸馏水试验封口处是否漏水。

二、 制备凝胶板

1．分离胶制备：取分离胶贮存液 5.0mL, Tris-HCl缓冲液(PH8.9)2.5mL,10％SDS 0.20mL, 去离子水10.20mL, 1％TEMED2.00mL置于小烧杯中混匀，再加入10% 0.1mL过硫酸胺，用磁力搅拌器充分混匀2min。混合后的凝胶溶液，用细长头的吸管加至长、短玻璃板间的窄缝内，加胶高度距样品模板梳齿下缘约1cm。

用吸管在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层重蒸馏水（约3－4cm），用于隔绝空气，使胶面平整。分离胶凝固后，可看到水与凝固的胶面有折射率不同的界限。倒掉重蒸水，用滤纸吸去多余的水。

浓缩胶制备：取浓缩胶贮存液3.0mL， Tris-HCl 缓冲液（PH6.7）1.25mL，1％TEMED2.00mL, 4.60mL去离子水，10% 过硫酸胺0.05mL，用磁力搅拌器充分混匀。混合均匀后用细长头的吸管将凝胶溶液加到长短玻璃板的窄缝内（及分离胶上方），距短玻璃板上缘0.5cm处，轻轻加入样品槽模板。

待浓缩胶凝固后，轻轻取出样品模槽板，用手夹住两块玻璃板，上提斜插板，使其松开，然后取下玻璃胶室去掉密封用胶框，用1%电泳缓冲液琼脂胶密封底部，再将玻璃胶室凹面朝里置入电泳槽。插入斜插板，将电泳缓冲液加至内槽玻璃凹口以上，外槽缓冲液加到距平玻璃上沿3mm处。

三 、样品处理

各标准蛋白及待测蛋白都用样品溶解液溶解，使浓度为0.5mg/mL，沸水浴加热3分钟，冷却至室温备用。处理好的样品液如经长期存放，使用前应在沸水浴中加热1分钟，以消除亚稳态聚合。

四、加样

一般加样体积为10－15μL（即2－10μg蛋白质）。如样品较稀，可增加加样体积。用微量注射器小心将样品通过缓冲液加到凝胶凹形样品槽底部，待所有凹形样品槽内都加了样品，即可开始电泳。

五、电泳

将直流稳压电泳仪开关打开，开始时将电流调至10mA。待样品进入分离较时，将电流调至20－30 mA。当蓝色染料迁移至底部时，将电流调回到零，关闭电源。拔掉固定板，取出玻璃板，用刀片轻轻将一块玻璃撬开移去，在胶板一端切除一角作为标记，将胶板移至大培养皿中染色。

六、染色及脱色

将染色液倒入培养皿中，染色1h左右，用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白区带清晰，即可计算相对迁移率。

七、结果处理

测量由点样孔至溴酚蓝及蛋白质带的距离（mm），计算相对迁移率（Rf）

Rf =样品移动距离（mm）/溴酚蓝移动距离（mm）

以标准蛋白分子量的对数作纵坐标，相对迁移率作横坐标制作标准曲线。根据样品蛋白质的相对迁移率从标准曲线上查出其分子量。

注意事项

（1）用SDS-凝胶电泳法测定分子量时，每次测量样品必须同时作标准曲线，而不得利用另一次电泳的标准曲线。

（2）因SDS可吸附考马斯亮蓝染料，染色前先用脱色液浸泡凝胶，洗去SDS。可使染色及脱色时间缩短，并使蛋白带染色而背景不染色。

• 若样品为水溶液，则需将样品溶解液的浓度提高一倍，然后与等体积样品溶液混合。

  
  

思考题

1．用SDS-凝胶电泳法测定蛋白质分子量时为什么要用巯基乙醇？

2．是否所有的蛋白质都能用SDS-凝胶电泳法测定其分子量？为什么？

(责任编辑：大汉昆仑王)