蛋白质分子量的测定（SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法）

一、原理

用聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离鉴定蛋白质（protein），主要依赖于电荷效应和分子筛效应。再与标准样品对照即可确定各区带的成分。要利用凝胶电泳测定某样品的蛋白质分子量就必须去掉其电荷效应，使样品的蛋白质分子的迁移率完全取决于分子量。

如在电泳体系中加入一定浓度的十二烷基硫酸钠（Sodiumdodecylsulfate简称SDS）。这种阴离子表面活性剂浓度大于1mmol/L时，以1.4gSDS与1g蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷，这种负电荷远远超过了蛋白质分子原有的电荷差别，从而降低或消除了各种蛋白质天然电荷差别。巯基乙醇是蛋白质分子中二硫键的还原剂，使多肽组分分成单个亚单位。

SDS可打断蛋白质的氢键。因此它与蛋白质结合后，还引起蛋白质构象的改变，此复合物的流体力学和光学性质均表明，它们在水溶液中的形状近似长椭园的棒状。不同蛋白质-SDS复合物的短轴相同，约1.8nm，而长轴改变与蛋白质的分子量成正比。

所以，各种SDS-蛋白质复合物在电泳中的迁移率不再受原有电荷和形状的影响，而只是按照分子的大小由凝胶的分子筛效应进行分离，其有效迁移率与分子量的对数成线性关系。这样就可以根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线得出末知样品蛋白质的分子量。

二、材料、仪器设备及试剂

（一）材料：小麦芽

（二）仪器设备：1.垂直板电泳槽及附件；2.直流稳压稳流电泳仪；3.微量进样器；4.其它常用用具。

（三）试剂：1. 下层胶缓冲液：18.17gTris，0.4gSDS，溶于水，用1mol/L HCl调pH8.8，定容至100ml。

2. 上层胶缓冲液：6.06gTris，0.4gSDS，溶于水，用1mol/L HCl调pH至6.8，定容100ml。

3. Acr/Bis贮备液：30gAcr，0.8gBis，溶解后定容至100ml。

4. 10%过硫酸铵，用时现配。

5. 样品缓冲液：Tris0.6g，甘油5ml，SDS1g溶于水，用HCl调pH至8.0，再加溴酚蓝0.1g，巯基乙醇2.5ml，定容至100ml。

6. 电极缓冲液：Tris3.03g，Gly14.14g，SDS1.0g，溶于水，用HCL调pH至8.3容至1000ml。

7. 染色液的配制：45%甲醇，0.25%考马斯亮蓝R-250。

8. 脱色液：2.5%甲醇，10%醋酸。

9. 1.5%琼脂：1.5g琼脂溶于100ml电极缓冲液中，加热溶解。

10. 标准分子量蛋白质。

三、实验步骤

1. 电泳槽的安装：干燥的两块玻璃板装入配套塑料夹套内，垂直固定在电泳槽上，周边用1.5%的琼脂密封。

2. 样品处理：将各种标准蛋白质和待测样品分别溶于蛋白质处理液（浓度2mg/ml），在沸水中加热3～4min，待冷却后作点样用。