体内荧光成像技术的最新进展

体内荧光成像技术利用一架灵敏的照相机，检测活的整体小动物荧光团的荧光发射，从而获得清晰的图像。为了克服活组织的光子衰减，通常优先选取近红外区（NIR）的长波发射荧光团，包括广泛应用的小分子靛炭菁染料。

NIR探针的数目最近随着有机、无机和生物荧光纳米颗粒的采用而不断增加。在体内荧光成像领域，成像策略和报道基因技术方面的最新进展包括一些改善探针特异性和亲和性的新技术以及调制和放大高灵敏靶点区域信号的新方法。其他方面的进展还包括旨在获得高分辨率、多峰形性和基于荧光寿命的体内荧光成像技术，等等。

导言

体内荧光成像技术类似于荧光显微镜，它们都使用一架低光度照相机和适当的滤光片，用以收集样品的荧光发射光。两者的不同点在于，前者是在一个肉眼可见的水平上进行操作，成像的对象是整体的小动物，而不是培养皿或载片上的细胞，由于延伸到体内环境，便可以从整体上展示完整的自然状态下的生物。

但是，体内荧光成像至少在两个方面遭遇到技术上的挑战。首先，厚而不透明的动物组织可以吸收或者衍射光子，产生强烈的自体荧光，所有这些都会使信号收集和测量变得模糊不清。其次，复杂的体内环境需要额外的造影剂或成像探针，而且这种造影剂或探针一旦分布于生物体内，必须具备生物稳定性，并且最好能优先累积于待测的靶点部位，产生此靶点特异的成像造影。

在描述组织光子传播的数学模式以及在探照和检测的仪器方面，过去已经取得明显进展，提高了组织定量荧光成像的性能，对此已有评述。所以，本文无意对体内成像技术所有方面作详尽的讨论，只想重点讨论成像探针化学和报道基因技术方面的最新进展。

荧光成像探针

在近红外区域（NIR，即700～1000nm）具有光吸收的分子，可以有效地用于显示和调查体内分子靶点，因为大多数组织很少会产生NIR荧光。最常用的有机NIR荧光团是聚甲炔类化合物，其中戊甲炔-和庚甲炔青色素，包括苯并、苯并噻唑、吲哚基、2-喹啉或4-喹啉等，最为有效。最近有两篇综述对它们的物理性质、生物分布、药物动力学和在体内荧光成像中的应用等进行了总结。

有一种新类型的体内荧光成像探针正在脱颖而出，这就是半导体纳米晶体或量子点。典型的量子点（QDs）有一个直径为2～8nm的核/壳结构，荧光发射强度依赖于直径的大小。QDs对于体内光学成像来说有着得天独厚的光学特点，这就是吸收性高、量子产量高、发射谱带窄、斯托克司频移大以及光褪色抗性强等。能够发射不同波长光谱的QDs可以为单一波长所激发，因此对于在一个实验中检测多靶点来说颇为适合。

最近已有数篇综述对QDs的合成、生物结合的化学、光学特性以及在体内成像中的应用进行了总结。设计荧光成像探针的一般策略可以粗略地分为非定靶探针与定靶探针两类。定靶探针又可细分为活性探针和可激活探针两组。

非定靶探针

吲哚花青绿是一种非定靶NIR探针，目前在临床上多用于测试血流和血液清洁度。此外，QDs也用作非定靶探针，而且业已表明它们是颇为有用的造影剂，在成年大白鼠脉管系统成像实验中就是如此。根据这一思路，Kim等制备了II型QDs，它们具有新奇的核/壳结构（即大多数电子囿于壳上，而在核中却呈空洞），在850nm处有较宽的发射谱带，它们已成功地用于小白鼠和猪的防御淋巴结的成像实验。

活性定靶探针

改善靶点部位造影剂积累的通用而简单的方法，是将荧光色素同能结合某一特异分子靶点（活性探针）的配体相耦合。该探针能结合到并停留在靶点部位，而非结合的探针则在循环中被清除。这种方法对于肿瘤的成像最为有用，因为癌症往往使得某些表面受体超表达。

配体可以是小分子、多肽、蛋白质和抗体。例如Tung等利用叶酸受体在被激活的、非静止的滑膜巨噬细胞上的表达，合成了一种叶酸-NIR荧光色素耦合体（NIR2-folate），用于与结缔组织炎症有关的活化巨噬细胞的成像实验。NIR荧光色素也用于成鼠肿瘤的体内成像实验，在此例中，对内皮细胞增生有高度特异性的血管内皮抑素（endostatin，一种血管生成内源抑制剂）被标记。另一个例子是膜联蛋白（Annexin V），科学家用花青素染料对它进行标记，以便摄制凋亡细胞中磷酰丝氨酸的影像。用活性探针对活动物造骨活动的荧光成像实验也取得成功，此探针是四磺酸庚次甲基吲哚花青素，它与结合了羟基磷灰石的配体帕米膦酸盐相耦合。报道表明，在体内肿瘤成像中，花青素染料和QDs同单克隆抗体和单链抗体部分都可以耦合在一起。

可激活定靶探针

可激活定靶探针一般用于酶活的功能成像。它们往往含有两个以上的等同或不同的色素团，两个色素团通过酶特异性多肽接头彼此紧密相连。这类探针主要呈黑色，没有或者很少发射荧光，这主要是由于非常相近（等同色素团）或者共振能的转移（不同色素团 ）所造成的淬灭效应所致。多肽接头的切除，使它们的荧光团释放出来，荧光发射于是得以恢复。因此，可激活探针的背景信号通常很低，但造影和检测的灵敏性却高于活性探针。一些可激活探针见于本文文献和某些综述。酶靶点主要限于蛋白酶，包括组织蛋白酶、半胱氨酸天冬氨酸特异蛋白酶、基质金属蛋白酶、凝血酶、HIV 和 HSV蛋白酶以及尿激酶类血纤维蛋白溶酶原激活剂，等等。

新荧光探针——小有机荧光团

化学家不断地研发着具有改良的荧光量子产量、高化学和光学稳定性、低聚合性和低细胞毒性的新NIR荧光色素。例如，Dehaen等利用钯催化的偶联反应合成了数个BODIPY衍生物，发射光范围从绿色到近红外不等。Zhao等报道了有一定构象的Aza-BOBIPY染料，它们的物理性质和化学与光学稳定性都得到改进。Tung等设计了一系列Nile蓝类似物，其激发光与发射光分别为640nm和680nm。这些小分子有机染料对于体内成像实验的功效尚需经过评定。Gremlich等所描述的NIR荧光嗪染料AOI987在血清中的最大发射光在670nm，最大激发光在650nm。AOI987可以穿透整个血脑屏障，故可用于转基因小白鼠中淀粉块的成像实验。

有机荧光纳米颗粒

目前已经研发出一大类用于药物传送的有机纳米颗粒，诸如脂质体、树枝状纳米体、聚合物纳米体等，这些也可用于体内光学成像。Therien 等通过两性双嵌段共聚物（diblock copolymer）的自身互相聚合，合成了NIR-可发射聚合体（聚合体球的直径在50nm～50μm之间），并将这些聚合体耦合到多（卟啉）NIR荧光团上。树枝状纳米体以前用作核磁共振成像（MRI）造影剂的载体，现在McIntyre等设计出一种以聚酰胺树枝状纳米体为基础的荧光底物，用以对肿瘤基质金属蛋白酶-7进行体内成像实验。业已表明，一种标以脉管内皮细胞生长因子（VEGF）和NIR染料Cy5的硼酸盐树枝状纳米体，可以选择性地同小白鼠乳腺癌失调的VEGF受体相结合。

荧光生物纳米颗粒

当多种荧光染料附着于同一分子（例如抗体）时，由于各种染料之间的淬灭效应，荧光强度反而会减弱，而不会增强。但是，如果用病毒外壳当标记的支撑架，则40多种Cy5染料便可以通过特殊的化学耦合作用加载于单一病毒颗粒上，由于分子间的距离较大，所以观察不到荧光淬灭。通过这种方法就可以合成具有一定结构的、直径在30nm左右的强荧光纳米颗粒，这种染料的局部浓度可以高达1.8 mM而无淬灭发生。标以Alexa染料的豇豆花叶病毒已经成功用以显示脉管系统和血流，而且用于在活小白鼠和鸡胚中人纤维肉瘤造成的肿瘤血管发生等情况。

自我发光的无机纳米颗粒

QDs的荧光发生需要外部光源的激发，这就限制了它们在活的不透明物质成像中的应用，其原因是，产生的荧光背景很强，而且在非表面部位有少量激发光。为了克服这些困难，我们设计了一种新类型QDs耦合体，它们能发光而无需外部激发。通过将羧酸盐QDs耦合于生物发光蛋白质海肾（Renilla）萤光素酶突变体的办法，就可以制备出这些自我发光的QD耦合体。荧光素酶对底物分解所释放出的能量，可以通过共振能量转移而传给QDs，导致QD光发射。这些自我发光的QD耦合体可以在活细胞和活动物中发出长波（从红光到近红外光）生物照明光，即使在深层组织中也如此，而且可以应用于多路体内成像。由荧光素酶与其他蛋白质的融合物（融合蛋白）也可获得相似的自我发光的QD耦合体，这有可能导致活生物其他生物活动的成像方法的出现。

成像新策略的出现——改进探针亲和性的多种途径

探针同靶点的紧密和特异性结合通常是成像成功的关键。因为许多成像靶点都位于细胞表面之外，所以多途径原则可以用来改善探针的结合亲和性。最近有两篇文献报道了用于异种移植肿瘤αvβ3整合素（integrin）体内成像的RGD（Arg-Gly-Asp）寡肽的设计。Cheng等合成了单体、二体和四体环RGD，并将它们耦合于Cy5.5，用于活小白鼠的肿瘤成像实验。Cy5.5-RGD 四体表现出最高的肿瘤吸收活性和最高的肿瘤-本底荧光比。Ye等对完整小白鼠中的线形多体RGD-cypate（一种近红外碳花青素分子探针）耦合物的内在化和定位进行了监控，发现αvβ3整合素受体结合亲和性和肿瘤吸收依赖于多价RGD成分的数目和空间排布。

寻找新探针的噬菌体文库筛选法

对系统的分子库筛选策略的研究已有很长时间，这类研究的目的是鉴定靶点特异性抑制剂和先导药物，最近已把此类研究延伸到分子成像领域。Newton等用体内噬菌体显示和micropanning分析（微筛法，噬菌体捕获分析）在小白鼠中选择能够溢出和结合人PC-3前列腺癌异种移植物的噬菌体，以用于体内成像的近红外染料AlexFluor 680对鉴定出的噬菌体克隆进行标记，结果显示，此克隆表现出高肿瘤-肌肉荧光比。组合化学法也用于筛选具有高亲和性的拟肽配体（LLP2A）探针。Peng等提出用于活细胞筛选的一珠一化合物的组合文库法，成功地鉴定出一种新的拟肽配体（LLP2A），该配体以高亲和性和特异性结合于αvβ3 整合素，可用于αvβ3 整合素体内肿瘤NIR成像。

可激活活性探针

活性探针能产生反差，这一结果是通过将探针保持在靶点部位、并且迅速从血液循环和非定靶部位清除造成的。对于高分子量的探针来说，这一清除过程非常缓慢。一个只有结合到靶点才能激发出荧光的探针，有望克服这一困难。最近Swager等设计出一种NIR染料，叫NIAD-4，它能跨越血脑屏障，特异地检测转基因小白鼠脑中的类淀粉-β沉积物。与以前述及的AIO987不同，NIAD-4当结合于凝集的类淀粉纤维时，它在610nm的荧光发射增加了400倍。Weissleder等报道指出，一种远红外吲哚花青素类荧光团，当结合于白蛋白时，荧光发射显著提高，因此适宜于用荧光分子断层扫描特异显示体内肿瘤组织。应用靶点激活的小分子荧光色素，是一种非常有用的细胞内靶点成像途径，因为造影机制并不依赖于探针是否快速从循环和非靶点部位清除。

探针的酶促摄入

Tsien等设计了一个酶促“认门”策略，借此选择性地将成像探针准确无误地输送到靶细胞。可激活探针由两个片段组成，一是为某一NIR染料所标记的能穿透细胞的多阳离子肽（CPP）；一是能够阻遏被CPP诱发的细胞摄入的多阴离子封堵肽。这两部分通过对基质金属蛋白酶-2（一种在肿瘤中高度表达的酶）敏感的多肽接头而连接在一起。此探针一经到达肿瘤部位，接头便被蛋白水解酶降解掉，释放出被标记的CPP部分，继而发生细胞移位。报道探针在靶点细胞中的积累，原则上可以导致信号放大和灵敏性提高。这种成像策略在体内已被证明是成功的，它能显示小白鼠纤维肉瘤细胞和植入的人鳞状上皮细胞瘤组织。我们最近证明，这一策略同样可用诸如QDs一类纳米颗粒来做。

基于连接的探针

以蛋白质活性为基础的蛋白质组学图式是应用荧光标记蛋白质底物或抑制剂而作出的，底物或抑制剂能同靶点酶形成共价加合物。 Blum等最近把这一策略应用到体内蛋白酶成像研究。他们的设计以半胱氨酸蛋白酶可以被酰氧甲酮共价抑制为依据，所用的探针是连接于淬灭剂酰氧基离去基团的荧光色素标记肽。在蛋白酶存在下，此探针就会发荧光，并且以共价键结合于酶上。虽然这一设计已经证明在活细胞中有效，但在体内实验中的效用仍待测试。

新报道基因技术——红和近红外荧光蛋白质

所谓报道技术就是应用报道基因作为必要工具研究基因表达和调节的技术。体内成像应用的报道基因有几种，其中编码荧光蛋白（FPs）的基因仍然最为常见，因为这些蛋白质有其遗传编码，易于应用，无需系统传送成像探针。在癌症研究中，以荧光蛋白为基础的体内成像，可以用来直接显示原始肿瘤的生长、侵染、转移扩散、肿瘤血管生成以及肿瘤与周围环境的相互作用。最先发现的FP是水母中的绿色荧光蛋白，其后利用遗传工程创造出许多突变体，所以荧光发射范围很广。Tsien等经过多次体细胞超突变结合荧光活化细胞计数，产生出具有红和近红外荧光（648nm）发射的荧光蛋白质变体，这些新的荧光蛋白质变体极大地克服了荧光颜色选择的限制，更适合于体内荧光成像研究。

β-半乳糖苷酶

β-半乳糖苷酶（β-gal）是另一种常用的报道蛋白，它能产生多种可被检测的荧光和颜色。例如，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-半乳糖苷（X-gal）通常用于β-gal基因表达的成色鉴定；而荧光素双-β-d-半乳糖苷酶（FDG）则可用于活细胞成像。此外，据最近报导，其改良低物TG-βGal可用于单相动力学活细胞成像，而且优于FDG。为了把β-gal的离体和活细胞成像方面的应用扩展到体内成像领域，Tung等发现，一种先前用到的底物吡喃半乳糖糖苷衍生物（DDAOG）可以用来显示活小白鼠中β-gal的表达。DDAOG被β-gal切割后，可以释放出荧光团DDAO，后者最大的发光波长在659 nm处，比DDAOG向红光方向移动了50nm。然而，DDAO的发射光谱同其激发光谱离得很窄，这就明显地限制了这一报道蛋白的灵敏性。另一个重要发展是β-gal体内成像中报道蛋白-酶循序技术，它极大地提高了β-gal报道蛋白的灵敏度。Blau等利用具有体内高度灵敏性的生物发光报道蛋白萤火虫荧光素酶（FLuc），并将它同叫做d-虫荧光素-d-半乳糖苷辅剂（Lugal）的商品底物结合在一起，用于β-gal的体内成像。β-gal先对Lugal进行切割，释放出d-虫荧光素，d-虫荧光素再经FLuc氧化而产生光。最近这些改进使得β-Gal成为集离体、细胞培养和体内成像大成的单一报道蛋白。

β-内酰胺酶

TEM-1β-内酰胺酶（Bla）是一小分子量（29kDa）的细菌单体酶，它是另一常用的报道蛋白，已广泛地用于生物学过程以及哺乳动物组织培养活细胞相互作用的检测和成像。例如，用Bla研究启动子和调节子的活性等，因为它可以显示RNA拼接、监测病毒感染、检测蛋白质之间的相互作用以及展示细胞表面蛋白水解酶的水解活性等，有关的荧光原底物多有报道。最近，我们设计了用于活细胞中Bla成像的细胞穿透性NIR 荧光原底物，我们用了一对荧光共振能量转移（FRET）体Cy5-QSY21。底物头孢菌素在7-氨基处连接于 NIR荧光团Cy5，同时在3′端连接于淬灭剂QSY21。此探针还连接了一个d-氨基葡萄糖类似物，以帮助细胞摄入活动。培养物中表达Bla的C6细胞可以用此探针进行成像。此外，科学家还对此探针进行了修饰，成功地对活小白鼠中C6神经胶质瘤进行成像。

生物素-链霉抗生物素蛋白相互作用介导的受体成像

与上述的三种光学报道蛋白系统相反，一种基于生物素-链霉抗生物素蛋白紧密相互作用的受体成像新技术，已被Tannous等用于培养物和体内报道蛋白标记细胞的成像。这种报道蛋白是一种重组膜蛋白（BAP-TM），它含有一生物素受体肽（BAP）。BAP可以被内源的生物素连接酶加上生物素而被“生物素化”，随后将被标记的链霉抗生物素蛋白注入，以便选择性地结合生物素化的报道蛋白。这种通用的技术可以用于其他形式的体内成像，例如核磁共振成像等。

新趋势——高分辨率体内成像

体内荧光成像技术与荧光显微镜不同之处在于，它所检测的是细胞群的大宗信号，但分辨率较低。与此相反，荧光显微内镜应用小光学探针（一般直径为0.25～1mm），将它们以最小损伤的方法插入固体组织中，达到组织深层高分辨成像的目的。这种技术与荧光探针相结合，可以在单细胞和单分子水平上检测活组织的生物活动。

多峰形性成像

体内荧光成像与核磁共振、X光计算机断层扫描（CT）一类剖视性成像互相配合，可以提供互补信息，克服荧光成像的缺陷，诸如光子对组织穿透性受限制以及三维空间分辨率低下等。多功能探针的研发日益受到关注，已经浮现出一些新技术研究，包括基于离子氧化物和树枝体的双MRI-荧光成像造影剂、X光计算机断层扫描（CT）-荧光成像融合技术系统等。

荧光寿命成像

目前大多数体内成像研究都局限于测量荧光强度的变化。但是，荧光寿命成像（FLIM）与光强度测量不同，它对探针局部浓度的依赖性小，从固有特性看，只要有光吸收和散射，它就能“大显身手”，虽然它对环境的变化十分敏感。近来，有些学者通过发展三维荧光寿命扫描成像以及用NIR肽探针对肿瘤异种移植进行成像的途径，开始研究在活的小动物中利用整体FLIM的问题。

结论

体内荧光成像技术可以展示整体活的小动物中荧光团的荧光发射状况。利用日臻完善的荧光探针和报道蛋白，这种技术正在成为探索基础研究和临床应用之间联系的重要纽带。传统的小分子NIR染料虽然继续被使用，但是用于体内荧光成像的有机、生物和无机的荧光纳米颗粒却提供了更有力的工具，在许多应用方面令人惊叹不已。这些纳米颗粒可以用作构建适合于多态成像的多功能探针。成像策略和报道蛋白技术的创新，定会极大地改进探针的特异性和灵敏度。基于高分辨率和荧光寿命的体内荧光成像的进展，可能会进一步增强成像技术的性能。这些新技术持续不断的进步，一定会有更多的分子靶点和疾病被成功探测出来。