表达EGFP的质粒和目的基因共转染并流式检测

在基因功能研究过程中，常常使用的一种方法就是将目的基因转到靶细胞内进行瞬时表达（transient expression），以流式细胞仪检测细胞周期的变化，观察转基因对细胞增殖的影响。由于各种转基因方法的不同，转基因的效率也不同，往往是仅有一部分细胞可以表达目的基因，没有转基因的细胞将影响检测的结果。

如何将已经转基因的细胞同未转基因的细胞区分开来进行检测，是一个技术上的难点。常用的一种方法就是将表达绿色荧光蛋白的质粒和目的基因共转染；在共转染时，加入目的基因表达质粒的量远高于表达GFP质粒的量，以保证表达GFP基因的细胞能够表达目的基因。

由于普通的GFP是表达于细胞胞浆内，在细胞周期检测过程中进行乙醇固定时，GFP会从胞内泄漏，造成无法区分转基因细胞和阴性细胞。

解决的方法是在GFP蛋白的末端加入膜定位信号，使GFP定位表达于细胞膜或胞内膜上，这样可以大大减少处理过程中GFP的泄漏、丢失，从而可以有效地区分转基因和未转基因细胞。

1、绿色荧光蛋白GFP只要蛋白不降解，荧光不会萃灭。若做稳定表达，那就可以随时观察荧光，但做稳定表达时程很长；若做瞬时表达，在转染后48小时左右应该就有GFP表达，可以观察荧光。

2、做荧光双标，一抗可以同时加，二抗也同时加。但是，两个一抗要不同种属来源，两个二抗用不同的荧光标记。比如说，第一个一抗为鼠抗A（单抗），第二个一抗为兔抗B；第一个二抗为抗鼠IgG（cy2标记，绿色荧光），第二个二抗为抗兔IgG（cy3标记，红色荧光）。在荧光显微镜下观察时，可以在同一个视野分两次激发观察，并分别照相，再将两次照相叠加。这样可以在同一个细胞内，观察抗原A和抗原B的亚细胞定位。

3、用转了绿色荧光蛋白的细胞来做另一种荧光检测，不会有什么问题。最好用cy3标记的二抗去染另一种蛋白。因为绿色和红色的差别很分明，二者叠加又是黄色的信号。