有关质粒共转染的问题

justinlee719：请教有关质粒共转染的问题！！！！！

我在做RNAi方面是新手，现在已经构建好载体，正准备转染，我选用的载体是ambion的Psciliner3.1H1-neo，说明书上说质粒里面带有GFP的干扰序列，需要用带有GFP的质粒共转染来做阳性对照，我对这方面现在还不太明白，我想请教一下各位老师对于这个带有GFP的质粒的选择有什么具体要求吗？另外有哪些质粒是专职表达GFP的呢？各位老师谁那是否有相关的质粒没有，是否可以赠送我一些？

另外还想请教各位一个比较低级的问题，如果我的shRNA表达载体里面不带有GFP这样的基因，那么判断它到底有没有转染进入细胞用什么办法呢？G418筛选好像是进行长期稳定转染用的，但是我用的正常的组织细胞，可能稳转比较困难，那么我在48小时以内如何判断质粒已经转入细胞了呢？

本人初接触RNAi，还有好多不太懂的地方，希望各位老师不吝赐教！谢谢

丁香园网友sdjlmu认为：

我没有见过载体的说明书，不过听你所述，因为载体里含有GFP的干扰序列，所以必须转一个含有GFP的质粒来作为阳性对照，说明载体质粒已被转了细胞里。现在有含有GFP的载体，有N端及C端的，可以将希望表达的目的基因置于其下游或上游，当然也可以做为空载体，只是单纯表达GFP蛋白，约26KD。

若不转GFP时，还有一个较好的方法，那就是转与不转二个细胞，转后进行细胞裂解，看你所要干扰的目的蛋白的表达量是否降低，若降低，则不仅证明可以转进细胞，还可以说明你的RNAI是有效的。

丁香园网友seaman_7717认为：

最好做一个stable clone，这个质粒本来就可以用G418来筛选的。然后你再转GFP的质粒，做阳性对照。其实对于转染效率不高的细胞（系），做stable是很有用的，可以保证整盘细胞转染效率低引起的knock down效率不明显。

我们阳性对照都是用GAPDH，内源的，容易检测。

丁香园网友justinlee719：

感谢各位战友的帮助，上周光忙着参加执业医师考试了，没来得及上网看帖子。关于sdjlmu朋友所说的：“现在有含有GFP的载体，有N端及C端的，可以将希望表达的目的基因置于其下游或上游，当然也可以做为空载体，只是单纯表达GFP蛋白，约26KD。”这个不是太明白，想请您解释一下，表达的目的基因置于上游或下游是什么意思？我对这方面接触的不是太多，所以还想请您多指教！

丁香园网友sdjlmu认为：

有pEGFP-N2此载体的GFP在载体MCS的N端，因此所表达目的蛋白的N端融合有GFP，C端同上。此载体主要是表达融合蛋白后，便于观察蛋白在细胞内的定位。