DC培养的几点疑问

最近忙于用邮箱回答网友们关于DC培养的问题。其中比较突出的问题是DC数量少或养不出来DC，细细比较他们的培养方法，发现许多网友采用“用不含GM-CSF的1640贴壁3小时”的方法，也有采用筛网过滤细胞的，下面我仅就“用不含GM-CSF的1640贴壁3小时”谈一点肤浅的看法，不当之处望诸位高手指正：

目前DC培养多数利用DC的前体细胞或者说早期DC贴壁，而晚期DC疏松贴壁的特性来培养和纯化的。

不少网友采用的“经典培养方法”是：

加含1640全培基（不含GMCSF和IL-4）放孵箱2小时后。弃去不粘附细胞。或：【再加入1640全培基，培养14-16小时后【评：骨髓细胞彻底向其他方向分化了，收集不粘附细胞】，即DC-rich..然后加入含GM-CSF和IL-4 20ng/ml的1640全培基培养六天。

以下是我的疑问：

1、加含1640全培基（不含GM-CSF和IL-4）培养3 小时？

把小鼠骨髓细胞从原来的血供丰富、37℃恒温、条件适宜的微环境中突然被换到培养环境，应该说有如新生儿从娘胎中来到人世间一样的巨变。我们都知道GM-CSF是诱导DC分化、生长和发育的，那么应该取出骨髓细胞后立即放到含GM-CSF的完全培养基培养，尽量减少细胞的环境巨变（或缓解环境的变化）或者减少在不适宜环境中的时间才有利于细胞的生长。

把从骨髓取出的细胞放到无GM-CSF的培养基折腾3小时再加入GM-CSF，再折腾16小时，我想如果把细胞比作新生儿，特别是自己的孩子你决不会把从娘胎中一出来就把他扔到荒野中冻几小时，然后在又在饥饿10多个小时，再拿出来再冷水中洗个澡，然后再在保育箱中精心培养吧？

2、“放孵箱2小时后，弃去不粘附细胞”？

细胞的贴壁决不是依靠重力沉下去或是靠胶水粘到壁上，如果是这样，那么悬浮细胞为什么永远不贴壁呢？

我认为（没有查过文献，特别是没有看过国外的相关文献，因此只能是“我个人看法”）：细胞的贴壁是因为具有贴壁功能的细胞在细胞膜上表达了黏附分子，才能试细胞贴壁，而表达的黏附分子性质或数量的不同决定了细胞的贴壁能力的强弱，悬浮细胞不表达黏附分子，因此永远不贴壁！刚从小时骨髓中冲洗出来的DC的前体细胞或者说早期DC，虽然悬浮在冲洗的培养基中，但它有贴壁的特性。

然而一个哺乳动物细胞能在短短的3 小时内完成基因的激活、mRNA的转录、蛋白合成和表达吗？当然原核生物是可以的，细菌几十分钟可分裂一代，但真核细胞特别是哺乳动物细胞是不可能的，我们用LPS刺激DC仅仅是为了让它的共刺激分子的表达提高一点，都要刺激两天。

因此我很想不通，从无到众的黏附分子表达只要3小时就够了。就我的实际体会（我亲自曾做过不下10次），哪怕在含GM-CSF的培养基中培养2天后，再把悬浮细胞移到另外的培养板中还可以养出相当数量的贴壁的DC集落。所以，我实在想不通某些DC高手是如何让DC的前体细胞在3小时内乖乖地立即贴壁的，而且在不含GM-CSF的情况下。因此，我认为“放孵箱2小时后，弃去不粘附细胞”，完成了把95％的DC前体细胞的“弃去”工作。

3、再加入1640全培基，培养14-16小时后，收集不粘附细胞？

基于上面的推断：“再加入1640全培基”，经过你上一步去除工作，再“培养14-16小时”，此时骨髓细胞已经向除DC以外的其他方向分化完毕，即使侥幸残存（非常顽强，铁了心一定要成DC）的那1、2个DC前体细胞基本上也已经贴壁了，再“收集不粘附细胞”，此时DC已经被100％的被完全彻底地消灭了。我个人认为用则两步来清除DC应该比任何方法都有效，因为每一步都切中要害，每一步周到得滴水不漏。

4、不含GM-CSF和IL-4的培养基先培养数小时？

我们都知道GM-CSF是诱导DC分化、生长和发育的。那么为什么一开始要用不含GM-CSF培养3 小时， 甚至几十小时后，再加GM-CSF呢？这样骨髓细胞已经向其他方向分化了，难道再用GM-CSF可以把粒细胞或巨噬细胞“逆分化”成DC吗？有如：我们在十字路口明明是要向右转，却一定要先向左转开一段路，再180度掉头向后转呢？就如我在第1点中说的，非要把DC细胞折腾到濒临死亡再开始养呢？

综上所述，我个人认为“加含1640全培基（不含GMCSF和IL-4）放孵箱2小时后【评：抑制DC的分化、生长核发育】。弃去不粘附细胞【评：清除绝大部分DC前体细胞】。再加入1640全培基，培养14-16小时后【评：骨髓细胞彻底向其他方向分化了】，收集不粘附细胞【评：仅存的DC其他细胞也被消灭了】，即【评：完全不含DC的培养体系建立了】DC-rich..然后加入含GM-CSF和IL-4 20ng/ml的1640全培基培养六天”

以上是我个人的愚见，欢迎诸位批评指正！