基因打靶技术的新进展

一、条件性打靶

条件性基因打靶(conditional gene targeting)可定义为将某个基因的修饰限制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定阶段的一种特殊的基因打靶方法。它实际上是在常规的基因打靶的基础上，利用重组酶介导的位点特异性重组技术，在对小鼠基因修饰的时空范围上设置一个可调控的“按钮”，从而使对小鼠基因组的修饰的范围和时间处于一种可控状态。利用Cre／LoxP和来自酵母的FLP—frt系统可以研究特定组织器官或特定细胞中靶基因灭活所导致的表型。

通过常规基因打靶在基因组的靶位点上装上两个同向排列的1oxP，并以此两侧装接上loxP的(“loxP floxed”)ES细胞产生“loxPfloxed”小鼠，然后，通过将“loxP floxed”小鼠与Cre转基因鼠杂交(也可以其他方式向小鼠中引入Cre重组酶)，产生靶基因发生特定方式(如特定的组织特异性)修饰的条件性突变小鼠。

在“loxP floxed”小鼠，虽然靶基因的两侧已各装上了一个loxP，但靶基因并没有发生其他的变化，故“1oxP noxed”小鼠表型仍同野生型的一样。但当它与Cre转基因小鼠杂交时，产生的子代中将同时带有“loxP floxed”靶基因和Cre基因。Cre基因表达产生的Cre重组酶就会介导靶基因两侧的1oxP间发生切除反应，结果将一个loxP和靶基因切除。这样，靶基因的修饰(切除)是以Cre的表达为前提的。

Cre的表达特性决定了靶基因的修饰(切除)持性：即Cre在哪一种组织细胞中表达，靶基因的修饰(切除)就发生在哪种组织细胞；而Cre的表达水平将影响靶基因在此种组织细胞中进行修饰的效率。所以只要控制Cre的表达特异性和表达水平就可实现对小鼠中靶基因修饰的特异性和程度。

二、诱导性打靶

诱导性基因打靶就是以Cre/loxp系统为基础、利用控制Cre表达的启动子的活性或所表达的Cre酶活性具有可诱导的特点，通过对诱导剂给予时间的控制或利用Cre基因定位表达系统中载体的宿主细胞特异性和将该表达系统转移到动物体内的过程在时间上的可控性、从而在1oxP动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行遗传修饰之目的的基因打靶技术。人们可以通过对诱导剂给予时间的预先设计的方式来对动物基因突变的时空特异性进行人为控制、以避免出现死胎或动物出生后不久即死亡的现象。

常见的几种诱导性打靶类型如下：四环素诱导型、干扰素诱导型、激素诱导型、腺病毒介导型。其优点有：

①诱导基因突变的时间可人为控制；

②在2个loxP位点之间的重组率较高；

③可避免因基因突变而致死胎的问题。

④如用病毒或配体／DNA复合物等基因转移系统来介导Cre的表达，则可省去建立携带Cre的转基因动物的过程。

如果在Cre—ERT和Ad—Cre表达系统中采用组织细胞特异的启动子来控制Cre的表达，其诱导的基因重组的组织细胞特异性还可进一步提高。

三、基因捕获技术

用常规方法进行基因打靶研究需耗费大量的时间和人力，研究者必须针对靶位点在染色体组文库中筛选相关的染色体组克隆，绘制相应的物理图谱，构建特异性的打靶载体以及筛选中靶ES细胞等，通常一个基因剔除纯合子小鼠的获得需要一年或更长的时间。面对人类基因组计划产生出来的巨大的功能未知的遗传信息，传统的基因敲除方法显得有些力不从心。

因此，基因捕获法应运而生，利用基因捕获可以建立一个携带随机插入突变的ES细胞库，节省大量筛选染色体组文库以及构建特异打靶载体的工作及费用，更有效和更迅速地进行小鼠染色体组的功能分析。

典型的基因捕获载体包括一个无启动子的报道基因，通常是neo基因，neo基因插入到ES细胞染色体组中，并利用捕获基因的转录调控元件实现表达的ES克隆可以很容易地在含G418的选择培养基中筛选出来。从理论上讲，在选择培养基中存活的克隆应该100%地含有中靶基因。中靶基因的信息可以通过筛选标记基因侧翼cDNA或染色体组序列分析来获得。

用基因捕获法在单次实验中可以获得数以百计的带有单基因剔除的ES克隆。这些克隆可以在96孔培养板中生长、复制并用于基因型分析，大规模地保存和分析中靶ES细胞在小型的实验室中也是可行的。此方法的缺点是只能剔除在Es细胞中表达的基因。

单种的细胞类型中表达的基因数目约为I04，现在的基因捕获载体从理论上来讲应能剔除所有在ES细胞表达的基因，因此，在ES细胞中进行基因捕获还是大有可为的。

1997年后，克隆技术接连取得重要突破，用哺乳动物体细胞可以克隆出新个体。可以设想，在体细胞中应用基因捕获可以剔除更多在发育晚期才表达的基因，其后通过核移植技术获得带有突变基因的动物个体、这不失为一种可以弥补以上缺陷的办法。用基因捕获法进行基因剔除的另一个缺点是无法对基因进行精细的遗传修饰，