关于细胞冻存及细胞复苏
丁香园
10464
冷冻保存方法
按照冷冻保护液在冻结后是否形成冰晶来划分，冻存方法可分为非玻璃化和玻璃化冻存两种。非玻璃化冻存是利用各种温级的冰箱分阶段降温至-700C～-800C，然后直接投入液氮进行保存；或者是利用电子计算机程控降温仪以及利用液氮的气、液，按一定的降温速率从室温降至-1000C以下，再直接投入液氮保存的方法。
以该种方法冻结的细胞悬液或多或少都有冰晶的形成。玻璃化冻存则是指利用多种高浓度的冷冻保护剂联合形成的玻璃化冷冻保护液保护悬浮细胞，直接投入液氮进行冻存的方法。以该中方法冻结的细胞悬液没有冰晶的形成。但目前细胞冻存最常用的仍是前一种方法。
一、非玻璃化冻存方法
下面以肿瘤细胞和杂交瘤细胞为例，介绍非玻璃化冻存细胞的详细过程。
主要材料
1. 仪器设备：普通冰箱、-300C低温冰箱和-700C～-800C超低温冰箱、液氮冻存罐、高速离心机、电子计算机程控降温仪等；
2. 冻存管：容量为1ml或1.5ml；
3. 冷冻保护液：一般是以9份小牛血清或细胞培养液与1份DMSO混合而成。现配现用，或配制后防入普通冰箱冰盒内冷冻保存。使用前，于室温下水浴溶解；
4. 待冻存细胞：各种肿瘤细胞或杂交瘤细胞。
操作过程
1. 待冻存细胞悬液的制备
(1)按常规方法消化处于对数生长期的细胞培养物，制备单细胞悬液，并计算细胞总数；
(2)将细胞悬液以800～1000r/min离心5min，去上清夜；
(3)向细胞沉淀物中加入冷冻保护液，轻轻吹打混匀，使细胞密度达1×106～1×107个/ml；
(4)按每管1～1.5ml的量分装于冻存管内，拧紧管盖；
(5)再冻存管上做好标记，包括细胞代号及冻存日期。
2. 分级冷冻
(1)先将冻存管放入普通冰箱冷藏室（4～80C），约40min；
(2)接着将冻存管置于普通冰箱冷冻室（-100C～-200C），约30～60min；
(3)将冻存管转入低温冰箱（-300C），放置30min左右；
(4)然后将冻存管转移到超低温冰箱（-700C～-800C），过夜；
(5)最后将冻存管投入液氮保存。
3. 记录
做好冻存记录。记录内容包括冻存日期、细胞代号、冻存管数、冻存过程中降温的情况、冻存位置以及操作人员。
冻存结果
如此冻存的细胞，其存活率可达90%以上。
讨论
在使用DMSO前，不要对其进行高压灭菌，因其本身就有灭菌作用。高压灭菌反而会破坏其分子结构，以致降低冷冻保护效果。在常温下，DMSO对人体有毒，故在配制时最好带手套。
在将细胞冻存管投入液氮时，动作要小心、轻巧，以免液氮从液氮罐内溅出。若液氮溅出，可能对皮肤造成冻伤。操作过程中最好带防冻手套、面罩、工作衣或防冻鞋。
应注意控制冻存细胞的质量。既要在冻存前保障细胞具有高活力，还要确保无微生物污染，这样的细胞才具有冻存价值。另外，在每批细胞冻存一段时间后，要复苏1～2管，以观察其活力以及是否受到微生物的污染。
冻存管宜采用塑料冻存管，不宜使用玻璃安瓿。因为在复苏时，需要从-1960C的液氮中取出冻存管，立即投入37～400C温水中，温差很大，玻璃安瓿瓶容易爆炸而发生危险。
二、玻璃化冻存方法
以下以人单核细胞为例说明这种细胞冻存方法（Takhashi et al. 1986）。
主要材料
1. 冷冻保护液：为Hanks平衡盐溶液加入20.5%DMSO（w/v）、15.5%乙酰胺（w/v）、10%丙二醇（w/v）和10%聚乙二醇（Mr 8000）而成。用2 mol/L NaOH调节pH至7.4，现配现用。
2. 冻存管：SILASTIC玻璃小管，内径3mm，外径4.5mm；
3. 设备：液氮储存罐；
4. 待冻存细胞：人类外周血单核细胞。
冻存过程
1. 用常规方法分离全血中单核细胞；
2. 在冰浴中预冷冷冻保护液；
3. 将装有单核细胞的离心管放置入盛有冰水的烧杯内（冰浴）；
4. 沿离心管壁缓慢滴加预冷的冷冻保护液。滴加过程为：前3min以0.3ml/min速度滴加，后5min以0.6ml/min速度滴加，余下的冻存液以0.75ml/min速度滴加。2×107个细胞要滴加15ml冻存液。滴加的时间在15min左右。最终细胞密度要在1×106～1.5×106个细胞/ml，边滴加边轻轻晃动离心管；
5. 轻轻吹吸混匀细胞冷冻悬液；
6. 将细胞冷冻悬液分装于冻存管中。12cm长的冻存管装0.8ml细胞冷冻悬液；
7. 将冻存管两端以火焰封口；
8. 最后将冻存管直接投入液氮中保存。降温速度约为6000C/min。
冻存结果
如此冻存的细胞，其存活率可达90%以上。
讨论
玻璃化冻存法对细胞活性的保存具有较好的效果，不需要复杂的仪器设备，具有液氮储存设备即可使用。目前，该方法已在胚胎冷冻方面得到广泛应用，但很少应用于一般细胞的冻存。这可能与需要配制较复杂的冻存液以及冷冻前和复苏后较烦琐的操作有关。
因为玻璃化冷冻保护液中的冷冻保护剂的浓度较高，室温下对细胞具有毒性（但在40C时毒性大为减弱）。所以，冷冻保护液的滴加全过程必须在40C冰浴中进行。另外，滴加速度要缓慢，如果滴加速度过快，则在细胞外产生很高的渗透压，造成细胞膜的损伤，导致细胞死亡，故要缓慢滴加，让冷冻保护剂有足够的时间缓慢渗透到细胞内，达到细胞内外的平衡。
冻存细胞的复苏
一、非玻璃化冻存的复苏方法
主要材料
1. 仪器设备：恒温水浴箱、高速离心机；
2. 培养用液：完全培养液。
复苏过程
1. 调配370C～400C的温水，或将恒温水浴箱的温度调节至370C～400C；
2. 从液氮中取出冻存管，立即投入370C～400C 温水中迅速晃动，直至冻存液完全溶解；
3. 将细胞冻存悬液转移到离心管内，加入约5ml培养液，轻轻吹打混匀；
4. 将细胞悬液经800～1000r/min离心5min，弃上清夜；
5. 向细胞沉淀内加入完全培养液，轻轻吹打混匀，将细胞悬液转移到培养瓶内，补足培养液进行培养。
结果
复苏后的细胞应该保持其冻存时的活力，活细胞数达90%以上。
讨论
细胞冻存悬液一旦融解后，要尽快离心除去冷冻保护液，防止冷冻保护剂对细胞产生毒性。实验人员在复苏细胞过程中，同样应具有自我保护意识，避免被液氮冻伤。
二、玻璃化冻存的复苏方法
以下以人的单核细胞为例说明其过程（Takhashi et al. 1986）。
主要材料
1. 设备：高速离心机；
2. 培养用液：添加20%胎牛血清的Hanks平衡盐溶液、培养液。
操作过程
1. 将冻存管从液氮中取出，立即投入冰浴中5min。复温速率约5600C/min。一次可以进行多个冻存管的复苏；
2. 将冻存管两端剪断，可以将5ml细胞冻存悬液转移到50ml离心管中；
3. 沿离心管壁缓慢加入已在冰浴中预冷的含20%胎牛血清的Hanks平衡盐溶液。前10min以0.2ml/min的速度加入，后10min 以0.5ml/min的速度加入，接着的15min以0.75ml/min的速度加入，最后30min以1ml/min的速度加入。全过程约为65min，都在冰浴中进行；
4. 将稀释后的细胞悬液以400r/min离心5min，去除上清。向细胞沉淀中加入培养液重新悬浮细胞，用于培养。
结果
复苏后的细胞应该保存其冻存时的活力，活细胞数达90%以上。
讨论
复苏时，冷冻保护液的稀释及去除过程与冻存前冷冻保护液的滴加过程一样，不能在室温下而必须在40C冰浴中进行，避免在室温下冷冻保护剂对细胞产生毒性。稀释过程也要缓慢进行，保证有足够的时间让冷冻保护剂从细胞内渗出，以达到细胞内外的平衡，避免高渗透压的损伤。
