脾细胞和骨髓瘤细胞的融合

1、脾细胞和骨髓瘤细胞一般按2：1-5：1的密度混合，有的报道可以到10：1，不过总体来说我们常选3：1-5：1，记住，原则是脾细胞的数量比骨髓瘤的多。

2、融合前，一般用HAT培养基做饲养细胞铺板，这是融合前的准备工作，因为饲养细胞分泌的某些细胞因子有助与融合的杂交瘤细胞生长，并且提供一定的细胞密度。通常是可以融合前一天做饲养细胞，老鼠选ICR或是BALB/C与ICR杂交的鼠，一只老鼠可以铺2-3块96孔板。

3、我们融合选用96孔细胞培养板。融合时将脾细胞与骨髓瘤混合后离心，然后用手掌稍稍搓离心管，将离心压紧的细胞松散开，再加融合剂PEG，在45秒内加完1毫升的PEG，之后静置30-60秒，这个时间时给PEG作用使细胞膜融合的，此时将离心管握在手中，利用自己的体温给细胞一个比较温暖的环境。

之后加30-40毫升DMEM终止（1640也行，只要用不完全培养基即可），一般前30-45秒速度慢一些，中间30秒可以一滴滴的加，最后30-60秒就快速加。终止后静置在37度水浴约10分钟，然后离心，用HAT重悬，分装96孔板即可。

4、融合后3-4天补加HAT培养基（2-3滴），融合后7-8天则开始给细胞换液，用HT培养基培养，根据你的细胞具体情况看，可以换1-2次液。一般细胞如果状态好的话，9-11天就可以生长起来了，后面检测细胞时HT培养细胞。