融合PCR实验

融合 PCR 是通过 PCR 的方法，将两段 DNA 序列连接到一起，处于相邻位置。一般来说， 融合 PCR 设计的引物序列的 5’端和 3' 端各包含一段待融合的模板序列，这条引物相当于衔接头，将两段 DNA 序列连接到一起。融合 PCR 技术最常用于全长序列的拼接，现在随着技术的发展，逐步应用于基因的破坏、基因的标记、序列缺失、两种基因的融合等领域。

融合 PCR 实验的基本原理是通过在上游引物的 5’端添加一段帽子序列，这 段帽子序列与靶 1 序列同源；而此引物的 3’端序列与靶 2 序列同源。这样，在第一个 PCR 反应中，以靶 2 序列为模板，使靶 2 序列得到扩增，而 扩增产物均携带与靶 1 序列同源或互补的序列。然后，以这样的扩增产物为引物，在第二个 PCR 反应中，以靶 1 序列为模板，使靶 1 序列得到扩增。这样得到的产物既含有靶 1 序列，又含有靶 2 序列，成为一段长片段的融合序列（见图 10-5）

器材：

PCR 仪、电泳仪等。

融合 PCR 实验的基本过程可分为如下几步，应用于基因插入的融合 PCR 的具体操作步骤，融合 PCR 过程如图 10-6 所示：

A 用标准的 PCR 方法，进行 3 个独立的 PCR 反应

PCR 反应 1：获得一个标签序列：采用引物 tag-F 和 Wg-R。

PCR 反应 2：获得目的基因起始密码子 ATG 的上游序列，约 500bp，采用的引物为 up-F 和 up-R，其中 up-R 含 24 bp 的序列与标签序列的 5’互补。

PCR 反应 3：获得目的基因起始密码子 ATG 及其下游序列，约 500 bp，釆用的引物为 do-F 和 do-R，其中 do_F 含 24 bp 序列与标签序列的 3’互补。

B 融合 PCR 反应

反应体系：3 种 PCR 产物按照大致相同的摩尔比混合（PCR 产物最好先分别纯化），总量约 100 ng，然后配成 50 μL 的反应体系，包括 5 μL 含 MgSO4 的 Pwo 聚合酶缓冲液、各 0. 2 mmol/L 的 dNTP，补加去离子水至 49 μL，将此反应体系加热到 94 °C 后，补加 1 μL Pwo 聚合酶（Roche）。

反应条件：94 ℃ 30 s-55 ℃ 1 min-72 ℃ 3.5 min，共进行 5 个循环。目的是使 3 种 PCR 产物互补延伸，最终形成全长的融合 PCR 产物。

C 融合 PCR 产物的进一步扩增

上面的 5 个循环做完以后，反应体系加热到 94 ℃，另加入 50 μL 反应溶液（5μL 含 MgSO4 的 Fwo 聚合酶缓冲液，各 0.2 mmol/L 的 dNTP, 1 μL Pwo 聚合酶，以及 5’和 3’端最末端的引物 up- F 和 dbR，去离子水补足额定体积）o 以 94 ℃ 30 s-55 ℃ 1 min-72 ℃ 3.5 min 为 PCR 反应条件，共进行 25 个循环。

得到的融合 PCR 产物包含起始密码子 ATG 上游 500 bp 的序列，标签序列，以及起始密码子 ATG 及其下游 500 bp 的序列。

1 同源互补区域的长度

由于融合 PCR 主要是利用两个片段 3’端的互补序列进行融合，所以待融合的片段越长，完整的融合产物的量越少。有时扩增产物在凝胶电泳中难以检测。但将待融合的两个片段之间的同 源互补区延长是增加融合物产量的一个好办法。如图 10-12 中操作流程（b）所示容易获得高产量，而操作流程（a）得到的产物量少卬七范宝昌等为了获得登革 2 型病毒的全长 cDNA 分子，将 5’半分子和 3’半分子的互补序列长度增加到 1.6 kb，保证了半分子退火后的正确匹配和中间体的稳定。

2 DNA 聚合酶的性能

融合 PCR 结果有时不理想，也与采用的 DNA 聚合酶的性能有关。在绝大多数情况下，推荐使用高保真的 DNA 聚合酶，以最大限度减少突变的产生。但保真性能好，扩增能力就有一定的局限，比如范宝昌等为了保证 11 kb 融合产物的获得，采用的是具有较好扩增能力，但保真度略低于 Pfu 的高保真 PCR 系统（B.M. 公司）。Wang 等的实验结果证明，如果高保真的 DNA 聚合酶的融合扩增效果不好，可以尝试利用普通 Taq 酶和高保真的 DNA 聚合酶混合使用。因为有的高保真 DNA 聚合酶对从琼脂糖凝胶和电泳缓冲液来源的模板比较敏感，不易获得好的扩增效果。

3 PCR 引物的设计和 PCR 反应条件

Oakley 实验室在进行如图 10-13 的融合 PCR 时，发现引物 P2 和 P5 距各自融合端衔接头的最佳距离为 1000 bp 左右，至于 P2、P5 以及待融合片段的重叠区域的长度都仅有 18〜21 bp。另外，他们为了保证在不同的 PCR 仪器上做出相同的 PCR 结果，他们规定了如下精细的 PCR 条件：

① 94 ℃, 2 min；

② 10 个循环：94 ℃ 20s，70℃ 1s，以 0.1 ℃/s 的速度降到 55 ℃，55 ℃ 30 s，以 0.2 ℃/s 升温 到 68 ℃，68°C 5 min；

③ 5 个循环：94 ℃ 20s, 70 ℃ Is，以 0.1℃/s 的速度降到 55 ℃, 55 ℃ 30 s，以 0.2 ℃/s 升温到 68 ℃，68 ℃ 5 min（以后每个循环加 5 s，最后一个循环延伸时间为 5 min 20 s）；

④ 10 个循环：94 ℃ 20 s, 70 ℃ 1 s，以 0.1 ℃/s 的速度降到 55 ℃ , 55 ℃ 30 s，以 0.2 ℃/s 升温 到 68 ℃, 68 ℃ 5 min 20 s（以后每个循环加 20 s，最后一个循环延伸时间为 9 min 20 s）；

在步骤 ③ 和 ④ 中，延伸时间的延长是考虑到 Taq 酶的活力在逐步减弱。经过他们的严格而精细的 PCR 程序设定，得到了单一而高浓度的特异性产物。

4 引物比例

实验操作中也发现，不同引物的比例也影响融合 PCR 结果。在一步融合 PCR 反应中，（原理同图 10-7 所示），Karremann 在同一个反应管中添加了所有的三种引物和需要的模板，利用一个 PCR 反应来获得融合产物。他发现，引物 1 的量对融合 PCR 的结果关系密切。当引物引物 2:引物 3 的比例为时，中间产物的积累效果明显，而融合产物的量少；当引物量之比为时，融合产物的量占到绝大多数；当进一步增大引物 1 与引物 2 和 3 的比例时（1:100:100、1:1000:1000. 1:10000:10000），融合 PCR 效果变得很差，几乎检测不到融台产物。因此，引物 1:引物 2:引物 3 的比例应保持在合适的水平。