制备单克隆抗体骨髓瘤细胞与脾细胞的融合
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制备单克隆抗体骨髓瘤细胞与脾细胞的融合
【材料和试剂】
（1）骨髓瘤细胞悬液 选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞，制备细胞悬液。
（2）免疫小鼠脾细胞悬液 取3天前加强免疫的小鼠，眼眶放血，分离血清冻存备用。拉颈处死小鼠，浸泡于75％酒精中3～5min。无菌操作取出脾脏，置入盛有5ml不完全培养液的平皿中洗涤，剪去周围的结缔组织，将脾脏移入另一盛有5ml不完全培养液的平皿中的钢网上，先用剪刀剪成3～5个小块，然后用注射器内芯研磨。将脾脏细胞悬液移至50ml离心管中，加不完全培养液50ml，1000r/min离心5min，弃上清，再以同法洗涤离心一次。然后将沉淀细胞重新悬浮于10ml不完全培养液中，计活细胞数，一般一只小鼠可得0.5～2×108 个脾细胞。
（3）饲养细胞，HAT培养基，24孔及96孔培养板等细胞培养所用材料和试剂。
【操作步骤】
（1）将准备好的骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按1：5～1：10比例混合，加入20～50ml RPMI-1640液，1000r/min×10min离心弃上清，用手指轻轻击打离心管底部，使沉淀细胞分散，将离心管置37℃水浴中。
（2）吸取1ml37℃预温的50％PEG缓慢滴入离心管内，1min内加完。37℃静置1～5min。
（3）在5min内滴加不完全完全培养液(37℃预温)20ml，第一分钟内滴加1ml，第2分钟2ml，第3分钟5ml，第4和第5分钟各6ml，同时应边加边轻轻地转动离心管，应沿管壁滴加，不应直接滴加在沉淀细胞上，以防将刚融合的细胞冲开。然后加1640液至50ml使PEG作用终止。
（4）800r/min×5～10min离心弃上清，将沉淀细胞轻轻悬浮于所需容积的HAT培养液中，接种24孔或96孔培养板。接种完毕后，将培养板放入37℃ 5％CO2 温箱中培养。
