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PCR-SSP检测人类白细胞抗原(HLA)B27表达水平的研究

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一、摘要

目的利用聚合酶链反应(PCR)进行HLA-B27的测定,探讨HLA-B27水平,正确评价HLA-B27的临床意义方法应用PCR技术进行人外周血白细胞的HLA-B27检测。结果采用该方法对各组病人外周血HLA-B27测定。结果表明:正常对照组,健康人70例,B27阳性3例,阳性率4.2%,48例原因不明的腰腿痛病人中B27阳性11例,阳性率22.8%,本组临床拟诊强直性脊柱炎(AS)患者70例,阳性58例,阳性率82.8%。

本组6例混合性脊椎炎患者B27全阳性。结论从实验结果来看,AS患者携带率明显高于正常人(P<0.05),揭示HLA-B27等位基因与AS的发生呈强相关。该基因的检测对AS的诊断有定的参考价值,对于临床诊断与鉴别诊断AS的发生有重要的帮助。

HLA-B27抗原为HLAI类抗原,存在于所有核细胞和红细胞表面,能刺激产生同抗体并控制细胞毒T效应细胞的特异性。HLA位点具有众的等位基因,造成HLA的极端多态性。它代表一家族包括几个紧密相关的等位基因(B2701-11)都具有密码子AAG、编码赖氨酸70(LYS)。近年来,由于分子生物学的进步,人们对B27包括其亚型的分子结构、种群分布以及B27亚型与AS的关系有深一步的认识。

资料表明95%的AS患者具有HLA-B27抗源,具有HLA-B27抗源者其患AS的几率为7.3%。因而,HLA-B27测定成为临床AS诊断与鉴别诊断的主要手段。本文拟建立一种PCR-SSP分子生物学检测技术,探讨HLA-B27的表达水平。我们对门诊骨科及住院骨科、内分泌科共124例患者,利用PCR-SSP技术,进行HLA-B27检测,现报告如下。

二、材料与方法

1. 方法

(1)DNA的提取检测取上述已抗凝混合匀的血液标本500 μ l放进1.5 ml 反应试管中,加700 μl 的ELB溶液,然后混合均匀(用吸管反复吸挤)。用低渗溶血法分离白细胞,再用高氯酸盐沉淀法提取外用白细胞DNA。分离出的DNA可以被溶解于水或DNA溶液缓冲液(如TE缓冲液),整个提取过程约需45~60 min,主要取决于样本量的多少。DNA能在2℃~8℃条件下贮存几个月,在-20℃条件下,储存更长时间。

(2)PCR扩增反应体系(13 μl),Pel-Freez标准PCRBuffer6μl;特异性引物5 μl,TaqDNA聚合酶0.08 μl,ddH2O 1.02 μl,模板DNA 0.9 μl。PCR扩增96℃预变性1 min,然后96℃ 25 s,70℃ 50 s,72℃ 45 s,进行30个循环周期,整个循环需65 min,Hold4℃,扩增110 min,取13 μ l扩增产物加2μl上样缓冲液置2%琼脂糖凝胶上电泳。

2. 统计学方法采用SPSS统计软件对结果进行χ2检验。

三、讨论

实验所用B27试剂盒包括3个反应孔,其中2个为特异性反应孔(1、2号管),另一个为污染监控孔3号管,两个特异性反应孔引物编号分别为PM138B(1号管)和PM053B(2号管)。

PM138B孔的阳性产物大小约为600bp左右;PM053B孔的阳性产物可能出现2条带,一条大小约为600 bp 左右,另一条大小为200 bp 左右。

只要出现一条阳性带即可判断此孔为阳性反应孔,两个特异性反应孔均为阳性,而污染盐护孔阴性者,即可判断其B27型。本文AS患者58例出现260 bp 的扩增条带,片段大小与设计的目的基因片段相同,为B27阳性结果,阳性率达82.8%,与文献报道一致。

混合性脊椎炎是一种以强直性脊椎炎伴有四肢关节炎的疾病,本文6例HLA-B27全为阳性,对临床诊断与鉴别诊断意义很大。对照组70例3例HLA-B27阳性,阳性率4.2%,与中国人HLA-B27频率为3.4%一致,强直性脊椎炎发病率为0.26%,具有HLA-B27抗原者其患AS的几率为7.3%,该基因的检测与AS的诊断有一定的诊断价值。

HLA-B引物混合物含有扩增1069bp片段的编码,人生长因子的对照引物。些引物的浓度大约是特性等位基因引物对的1/5,目的是为成功的PCR扩增反应提供一个内部对照,这种扩增常发生。

例如:在特性等位基因或基因组PCR片段存在或缺失的情况下发生扩增反应。

因此,在PCR反应中一般能看到对照带。偶而在特性等位基因HLA-BPCR产物存在下,对照组出现或消失,这不是局限性,因为特定的带为成功PCR程序提供检查。被PCR拟制剂污染的DNA,诸如血红蛋白、肝素、乙醇等能严重干扰PCR反应,因此,肝素不应作为DNA分离原料,因使用EDTA或柠檬酸抗凝。

强直性脊柱炎是当一种常见病、多发病,以侵犯骶骨关节、脊柱等活动较差的大关节为主,致残率高。

过去一致把AS病与类风湿关节炎(RA)相混肴,或称为"类风湿关节中枢型";误诊率高达60%,X线检查只能提示AS病的中晚期炎症改变,难以确定炎症性质,因而延误治疗时机。对AS病早期确诊,及时治疗至关重要,使远期预后良好。所以,对有上述症状患者作HLA-B27检测可早诊断、早治疗,以免致残。根据BERRETTONT公式可计算出带来有B27抗原与不带有B27抗原时诊断AS的概率。

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