缺口平移法探针标记

探针的标记方法很多，大致可以分为两大类：引入法和化学修饰法。引入法是运用标记好的核苷酸来合成探针，即先将标记物与核苷酸结合，然后通过DNA聚合酶、RNA聚合酶及末端转移酶等将标记的核苷酸整合入DNA或RNA探针序列中去。化学修饰法即采用化学方法将标记物掺入已合成的探针分子中去，或改变探针原有的结构，使之产生特定的化学基团。引人法较化学修饰法更常用．按其整合的方法不同?引入法可分为缺口平移法、随机引物法、末端标记法和PCR扩增标记法和RNA体外转录法等。

缺口平移法(nick translation)是一种最常用的标记双链DNA探针的方法，该方法利用DNA聚合酶I的多种酶促活性将标记的三磷酸脱氧核糖核苷(dNTP)掺入到新合成的DNA链中，从而合成高比活性的均匀标记的DNA探针。

其基本原理是首先用适当浓度的DNA酶I在DNA探针分子的一条链上打开缺口(nick)，缺口处形成3，羟基末端；利用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 5， →3， 方向外切酶活性，将缺口处5， 端核苷酸依次切除；与此同时，在大肠杆菌DNA聚合酶I的5， →3， 聚合酶活性的催化下，以另一条DNA链为模板，以dNTP为原料，顺序将dNTP连接到切口的3， 羟基上，从5， 端向3， 端方向重新合成一条互补链。

其结果是在缺口的5， 端，核苷酸不断被水解，而在缺口的3， 端核苷酸依次被添加上去，从而使缺口沿着互补DNA链移动，原料中含有的标记核苷酸因此替代原DNA分子上的部分核苷酸而掺人到新合成的DNA链中，从而获得标记的DNA探针。此方法的缺点是需要较多的DNA模板(＞200ng)，且标记效率较低。

探针缺口平移法标记原理图