探针标记方法

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探针的原理及其应用

探针 标记方法有

①DNA的缺口平移法。缺口平移是一种快速、简便、成本相对较低以及生产高比活性均一标记DNA的方法。该技术可以制备序列特异的探针。当使用重组质粒探针时，虽然任何形式的双链DNA都可以进行缺口平移标记。但通常使用限制性核酸内切酶将插入片段进行酶切和凝胶电泳 纯化后再进行缺口平移标记。此外，用这种探针进行杂交可产生较低的背景信号。

②DNA的随机引物法。这种方法是使用寡核苷酸引物和大肠杆菌DNA聚合酶 Ⅰ的Klenow片段来标记DNA片段。这种方法可代替缺口平移产生均一的标记探针外，还在许多方面优于缺口平移法，比如标记核苷酸在DNA探针中的掺入率可达50％以上。由于在反应过程中加入的DNA片段不被降解，故在随机引物反应中加入的DNA可少于200 ng，甚至10 ng也能有效地标记。DNA片段的大小不影响标记的结果。标记物沿所加入的全长DNA被均等地掺入。标记的探针可以直接使用而不需要去除未掺入的核苷酸；单链双链DNA都可作为随机引物标记的模版。随机引物可用于较小的DNA片段（100~500 bp），而缺口平移法对大DNA片段（>1000 bp）效果最好。随机引物法的主要缺点是产生的标记探针量比缺口平移的要少些，此外环状DNA不能有效地标记，必须先用限制性内切核酸酶线形化或用碱法或DNA酶Ⅰ产生缺口。

③RNA的体外转录法。体外转录法标记RNA探针可用于商品化转录质粒来制备。这些质粒中应该包括SP6、T3、或T7 RNA聚合酶的RNA启动位点和，而这些启动位点则与多克隆位点（multiple cloning sites，MCS）相邻。

④RNA的寡脱氧核苷酸法。克隆质粒pSP64、pGEM-3、pGEM-4等含邻近MCS的SP6RNA启动子，可作为从DNA寡核苷酸模版产生RNA探针的基础。这两种标记方法产生探针量大，而且产生的探针不受载体序列的影响，所需要的线性化的质粒DNA大约1 ug，但需要高纯度的模板。

⑤寡核苷酸的“接尾法”。末端脱氧核苷酸转移酶可将三磷酸脱氧核苷加到DNA分子游离的3’-OH末端。这种脱氧核苷酸连接将在探针3’末端形成一个延伸的“尾巴”。用这种方法可加上许多基因以产生高比活性的探针，适用于基因库中克隆序列的鉴定，基因组DNA样品的点突变检测和原位杂交。

⑥5’端寡核苷酸的T4多聚核苷酸激酶法。T4多聚核苷酸激酶可将γ-32P-ATP的γ-磷转移到游离的5’-OH端上。合成寡脱氧核糖核苷酸时，它们通常未被磷酸化，因而在5’端应含有一个羟基。由于探针分子只掺入了一个同位素分子，故探针活性与其长度有关。短寡核苷酸可被高比活性标记，而较长的探针活性则随其长度增加而降低。这种激酶标记方法最常用于DNA序列测定。

⑦聚合酶链反应标记法。聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）用于标记比活性DNA片段，这种技术具有很高的特异性，可以在1~2 h之内大量合成探针DNA片段，标记物的掺入率可高达70％~80％。因此，PCR标记技术特别适用于大规模检测和非放射性标记。该方法的缺点是需要合成一对特异性PCR引物。使用从探针DNA上制备的小片段引物也能取得较好的标记效果。

一般来说，核酸探针的检测方法应根据核酸探针的标记物来决定。放射性同位素可通过放射自显影而使其标记的核酸探针得到检测。