SDS碱裂解法小量提取小麦基因组DNA
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1、取0.1~0.2 g左右小麦叶片于1.5 ml的Eppendorf离心管中,将离心管直接放入盛液氮的冰壶中冷冻。从冰壶中取出离心管,用小玻璃研棒直接插入离心管中迅速研磨,至淡黄色粉末为宜;
2、向离心管中加入600 ml的DNA提取缓冲液S,振荡充分混匀,65 ℃水浴30 min,其间温和混匀几次;
提取缓冲液“S”配制:
100 mmol/L | Tris-HCl pH8.0 |
100 mmol/L | NaCl |
50 mmol/L | EDTA pH8.0 |
2% | SDS |
3、加入等体积的酚-氯仿(V/V=1:1)温和混匀,8000 rpm,4 ℃离心10 min;
4、取出离心管,吸上清液移入另一干净离心管中,加入等体积的氯仿混匀后8000 rpm,4 ℃离心10 min;
5、取上清,加入2/3体积预冷的异丙醇,温和混匀,静置5~10 min,勾出絮状的DNA沉淀,用70%的乙醇洗2~3次,无水乙醇洗1次,然后置于通风厨中自然风干或冷冻抽干机抽干;
6、根据DNA量的多少,加入20~100 靗 ddH2O或TE充分溶解;
7、增加体积至600 ml,加入1.8 ml RNaseA(10 µg/μl),37 ℃温浴30 min;
8、重复步骤(3)和(4),取出上清液,加入1/10体积3 mol/L醋酸钠及二倍体积冷的无水乙醇,轻轻混匀,静置一段时间后勾出DNA,用70%的乙醇清洗2~3次,无水乙醇洗1次,真空抽干或吹干;
9、根据DNA量的多少,加入20~100 μl ddH2O或TE充分溶解。用紫外分光光度计测量DNA的浓度,1.0%琼脂糖电泳测定DNA纯度。