多肽的固相合成、切割及纯化

互联网2012-08-21

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固相肽合成（solid phase peptide synthesis, SPPS）技术是现代蛋白质化学的一项关键技术，也是对现代分子生物学和基因工程研究具有重大影响和重要意义的技术。

它的基本过程为：

1、偶联保护氨基，即将第一个保护氨基以共价键偶联外固相载体上（在合成过程中始终不能脱落）。

2、脱保护，在侧键基团保持稳定条件下脱去氨基上的保护，暴露出自由氨基，例如脱去Fmoc。

3、偶联，将下一个已活化的氨基酸与结合于固相的前一个氨基酸缩合形成肽键。

4、肽键延长，反复进行脱保护与偶联两步使肽键延长到设计长度。

5、切割，将合成的肽由固相载体上切割下来并脱去侧链保护。

6、纯化，切割后的肽进行纯化、鉴定。下面以合成的huBPP为例，简介在Pioneer上的合成切割及纯化过程：

一、huBPP的合成

（一）仪器及试剂

Pioneer肽合成仪、氩气，纯度99.99% 、二甲基甲酰胺（DMF）、哌啶、HATU 、二异丙基乙胺、甲醇、TFA（三氟乙酸）、合成需要的侧键保护氨基酸、树脂 Fmoc-PAL-PEG-PS

注：Fmoc-芴甲氧羰基（Fluoreny lmethyl oxoxy carbonyl）

PEG-聚乙二醇

PAL-肽酰胺接头（peptide amide linker）

PS-树脂（polystyrene）

（二）合成原理

（三）合成过程

准备气体→冲洗管路→检查管路→合成准备（装试剂、输入序列等）→合成→合成结束

（四）操作程序

1．开机及调节气压、检查是否漏气

1）依次打开电源开关、UPS开关、计算机

2）安装所有的瓶子（空）

3）检查氦气罐内气体量（保证剩余量>200PSI），输出压力为20PSI

4）打开合成仪电源，等待仪器进入主菜单

5）按Tools-Ding-I/O1

6）打开气体阀Gas Valve(4) ON回主菜单

7）按Manul-Fluidie System 1 -Wash

8）调节压力到6±0.2PSI，回主菜单

9）按Tools-Diag-Leak-Start，回主菜单

2．冲洗系统管道

1）按Tools-Bottle

2）在Wash瓶内装入2L DMF

3）主菜单中按Prime-Prime Individual，回主菜单

4）按Prime-More-Start up/Shut Down-Column 1

5）对Column2重复上一步操作

6）回主菜单

3．检查每个瓶子的管道

1）按Tools-Bottle

2）在所有瓶内装入50mL DMF，回主菜单

3）按Prime-Prime Lines-Column1-OK，回主菜单

4）按Manual-Fluidic System1(2或Both，视情况而定) -Wash-Fluid Destination至Wast出现-YES

5）打开Wash瓶，抽出管道-Start，检查两个管道是否通畅-Cancel

6）重复以上各步，分别检查各个管道是否通畅。回主菜单

7）对Column2同样操作，回主菜单

4．合成准备

1）按Tools-Bottle

2）卸下各个瓶子，装入用于合成的试剂，回主菜单

3）按Manu1-Transport System1(2或Both) -End

4）在第1至n位中放入氨基酸（放置顺序与合成序列相反），第n+2位放一个空管

5）在Transport System视窗中循环按Adv-Align检查每个位置是否有氨基酸管同时观察探针运动是否正常

6）按Prime-2-System Prep-Column 1-OK，cancel

7）不要接柱子，对Column2同样操作

8）装柱并上柱

9）Prime4-Column Prep-Column 1-OK, 对Column2同样操作

10）按Tools-Config-Def-OK，回主菜单

11）按Seq-Edit-Ins输入要合成的序列

12）Seq Menu-Run-Column 1(2或Both) 必要修改参数-OK

13）注：序列输入以及参数的设置也可以在计算机上进行。