多肽的固相合成、切割及纯化

互联网2012-08-21

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固相肽合成（solid phase peptide synthesis, SPPS）技术是现代蛋白质化学的一项关键技术，也是对现代分子生物学和基因工程研究具有重大影响和重要意义的技术。

它的基本过程为：

1、偶联保护氨基，即将第一个保护氨基以共价键偶联外固相载体上（在合成过程中始终不能脱落）。

2、脱保护，在侧键基团保持稳定条件下脱去氨基上的保护，暴露出自由氨基，例如脱去Fmoc。

3、偶联，将下一个已活化的氨基酸与结合于固相的前一个氨基酸缩合形成肽键。

4、肽键延长，反复进行脱保护与偶联两步使肽键延长到设计长度。

5、切割，将合成的肽由固相载体上切割下来并脱去侧链保护。

6、纯化，切割后的肽进行纯化、鉴定。下面以合成的huBPP为例，简介在Pioneer上的合成切割及纯化过程：

一、huBPP的合成

（一）仪器及试剂

Pioneer肽合成仪、氩气，纯度99.99% 、二甲基甲酰胺（DMF）、哌啶、HATU 、二异丙基乙胺、甲醇、TFA（三氟乙酸）、合成需要的侧键保护氨基酸、树脂 Fmoc-PAL-PEG-PS

注：Fmoc-芴甲氧羰基（Fluoreny lmethyl oxoxy carbonyl）

PEG-聚乙二醇

PAL-肽酰胺接头（peptide amide linker）

PS-树脂（polystyrene）

（二）合成原理

（三）合成过程

准备气体→冲洗管路→检查管路→合成准备（装试剂、输入序列等）→合成→合成结束

（四）操作程序

1．开机及调节气压、检查是否漏气

1）依次打开电源开关、UPS开关、计算机

2）安装所有的瓶子（空）

3）检查氦气罐内气体量（保证剩余量>200PSI），输出压力为20PSI

4）打开合成仪电源，等待仪器进入主菜单

5）按Tools-Ding-I/O1

6）打开气体阀Gas Valve(4) ON回主菜单

7）按Manul-Fluidie System 1 -Wash

8）调节压力到6±0.2PSI，回主菜单

9）按Tools-Diag-Leak-Start，回主菜单

2．冲洗系统管道

1）按Tools-Bottle

2）在Wash瓶内装入2L DMF

3）主菜单中按Prime-Prime Individual，回主菜单

4）按Prime-More-Start up/Shut Down-Column 1

5）对Column2重复上一步操作

6）回主菜单

3．检查每个瓶子的管道

1）按Tools-Bottle

2）在所有瓶内装入50mL DMF，回主菜单

3）按Prime-Prime Lines-Column1-OK，回主菜单

4）按Manual-Fluidic System1(2或Both，视情况而定) -Wash-Fluid Destination至Wast出现-YES

5）打开Wash瓶，抽出管道-Start，检查两个管道是否通畅-Cancel

6）重复以上各步，分别检查各个管道是否通畅。回主菜单

7）对Column2同样操作，回主菜单

4．合成准备

1）按Tools-Bottle

2）卸下各个瓶子，装入用于合成的试剂，回主菜单

3）按Manu1-Transport System1(2或Both) -End

4）在第1至n位中放入氨基酸（放置顺序与合成序列相反），第n+2位放一个空管

5）在Transport System视窗中循环按Adv-Align检查每个位置是否有氨基酸管同时观察探针运动是否正常

6）按Prime-2-System Prep-Column 1-OK，cancel

7）不要接柱子，对Column2同样操作

8）装柱并上柱

9）Prime4-Column Prep-Column 1-OK, 对Column2同样操作

10）按Tools-Config-Def-OK，回主菜单

11）按Seq-Edit-Ins输入要合成的序列

12）Seq Menu-Run-Column 1(2或Both) 必要修改参数-OK

13）注：序列输入以及参数的设置也可以在计算机上进行。

5．合成

从主菜单按Strt1、Strt2，开始合成，直到结束。

（五）合成结束后处理

小心卸一柱子，倒出肽合成树脂。若切割时，可按切割程序进入，否则将合成肽树脂冷冻干燥后保存。

（六）合成过程的检测报告

1,，资源报告；

2，脱保护图谱；

3，合成过程UV检测图谱

a，脱N端的Fmoc紫外吸收；

b，去Fmoc，洗柱紫外吸收；

c，溶解待合成接上去氨基酸的紫外吸收；

d，偶联氨基酸到柱子上；

e，洗探针的紫外吸收；

f，如果使用延时合成时对检测器冲洗的紫外吸收；

g，洗涤柱子的紫外吸收。

二、合成肽的切割

切割（Cleavage）属于肽合成的后处理部分，是指将已合成的肽从载体（树脂）上切割下来。有人认为也包括脱去侧链保护。切割及去保护是合成中最重要步骤。如果试剂和反应条件选择不当，产物会发生不可逆的修饰而被破坏，因此在切割时应注意以下几个问题：1、选择合适的切割及脱保护试剂，根据合成肽氨基酸的不同而选择；2、选择合适的试剂浓度、反应时间、温度等条件；3、氨基酸侧链的保护，在切割时，切割试剂或切割产物可能对一些对其敏感氨基酸侧链造成破坏或修饰，因此，反应时要选择合适试剂和条件，必要时，对敏感侧链进行保护，使其遭到最小程度的破坏。

（一）切割试剂及条件

试剂配方：TFA/phenyl/water/TIPS=88/5/5/2

条件：
用量 0.5g介质/5ml TFA液

温度冰浴中

时间 2h

（二）切割操作流程

（三）切割检测

1，茚三酮定性反应，检测介质上huBPP切割是否完全

取4支试管，分别加入①未切割介质；②合成前介质；③已切割介质；④甘氨酸少许，分别加入0.5ml-1ml酸水（<pH3），再加入少许茚三酮，水浴加热，观察颜色变化。氨基酸与茚三酮反应呈紫色。

2，HPLC法：检测切割后肽的纯度

HPLC条件：

仪器：Beckman gold system

色谱柱：DiamonsilTM C18 5μl，250×4.6mm，迪马公司产品

流动相：A: 0.1% TFA

B: 0.1% TFA-CH3CN

洗脱梯度：B: 0~100% 20min

流速：1ml/min

检测波长：245nm

样品准备：取切割后水相液体过0.45μl水性膜，取20μl上样。

结果分析：观察与对照品的保留时间，峰面积百分比等参数。

三、合成肽的纯化

在肽的合成和切割中会产生一不完全肽、反应副产物、残留试剂等，有必要对肽进行纯化。

有关肽的纯化和蛋白质纯化、鉴定有许多相似之处，如均可用色谱纯化，但也在它的特殊性，如分子量太小，不易透析除盐，一般不易用常规SDS-PAGE鉴定等，所以，它的纯化、鉴定应根据肽的特性来设计。HuBPP水溶性好，可以用离子交换色谱如Q-Sepharose FF纯化，平衡液pH选在7.0即可。也可以用反相柱纯化。下面介绍huBPP的反相纯化方法。

（一）仪器及试剂

仪器：Waters 650半制备色谱仪

色谱柱 Prep Park 25×10 Cartridge

内柱：Delta-PakTM C18 100A 15μ

乙腈

（二）纯化过程

样品准备

将切割后水相离心，或过滤除杂，备用

平衡柱子，用H2O平衡柱子，流速3ml/min，到基线平稳

上样，注入5ml样品

洗脱：B液：0~60% 30min

分部收集洗脱峰

（三）鉴定

纯度鉴定：将各峰分别上HPLC反相柱分析，条件见高效液相色谱实验中反相色谱部分。

含量测定及计算收率：用Lorry's 法测定切割、纯化各步骤中的肽含量度计算收率。