限制性内切酶常见问题及注意事项

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1)购买的限制性内切酶 带有两种不同的酶切缓冲液，该用哪一种?

每种限制性内切酶 带有一管酶的最适反应液(通常是一种4-CORE反应液)，可能还带有一只MULTI-CORE反应液。

2)4-CORE酶切缓冲液体系是什么?

大多数(大约75%)Promega公司的限制性内切酶 有一种最适酶切缓冲液，即4-CORE酶切缓冲液，分别叫作A、B、C和D。其余的25%的限制性内切酶带有一种特定的酶切缓冲液(酶切缓冲液E-L)。每一种限制性内切酶带有一只最适酶切缓冲液。

3)MULTI--CORE酶切缓冲液体系是什么?

MULTI--CORE酶切缓冲液适用于双酶切。每一种Promega公司的限制性内切酶 都测试了在MULTI--CORE酶切缓冲液中的活力，如果酶切活力达25%，就提供一只MULTI--CORE酶切缓冲液。作双酶切时，如果两个酶在MULTI--CORE酶切缓冲液中的活力达到50-100%，就可替代A-L酶切缓冲液。应选用酶活力最高的酶切缓冲液。

4)如何保存限制性内切酶 ?

不太常用的限制性内切酶多保存在-70oC,每周或每天用的酶保存在-20 oC。有一些酶需要不同的保存条件。每一种Promega公司的限制性内切酶都提供一份分析说明以供查讯。使用限制性内切酶时，应将酶保存在冰上。

5)一般的限制性内切酶反应中(也叫消化)，应用多少内切酶?

所用的酶量取决于DNA的纯度、量和型态。限制性内切酶的活力单位定义为在适当的温度下，在1小时内，1ugDNA在50ul体积中，被完全消化所需的限制性内切酶的量。一般说来，线性DNA比超螺旋DNA更易消化。比如，酶切1uglambdaDNA，需要1-2单位的酶，而酶切1ug质粒DNA，需要3-5单位的酶。

6)使用限制性内切酶的一般步骤是什么?

一般步骤如下：

A)测试酶切DNA的量

B)计算完全酶切所需的酶量。为使终体积中甘油的浓度低于8%，计算能加的酶量，最多能加终体积的10%(甘油的浓度为5%)。

C)10X反应液的体积应为终体积的1/10;10X反应液的体积不应小于酶的体积。

D)加入计算好的DNA，10X反应液，酶。

加入水到终体积(20-50 ul)，轻轻混匀，在适当的温度下保温。一般酶的最适温度为37 oC，但有例外。应查讯分析说明。

比如：

质粒DNA (2ug/ ul) 5 ul

10X反应液 5 ul

酶(5ug/ ul) 5 ul

dH2O 35 ul

50 ul

37 oC保温2-3小时。

应最后加酶。

7)一次使用两个限制性内切酶的一般步骤是什么(比如双酶切)?

一次使用两个限制性内切酶的一般步骤，如同使用一个限制性内切酶的一般步骤。但要注意两个限制性内切酶在同一种缓冲液中都要有活力。甘油的浓度不应超过终体积的8%。应注意有些酶对末端敏感，活力差。

8)能否在一次反应中用很多的限制性内切酶?

可以，一般而言，甘油浓度超过8%对酶切有抑制。有些酶在高的甘油浓度中会产生星活力。限制性内切酶提供在50%的甘油中，故10 ul反应体积中不应加入超过1.6 ul的酶。

9)消化反应中是否需要加牛血清白蛋白(BSA)?

不需要。酶切不需要加BSA。但Promega公司的限制性内切酶活力测定时，均加入乙酰化的BSA达0.1mg/ml。BSA可以提高许多限制性内切酶活力。Promega公司的限制性内切酶均提供一管乙酰化的BSA(R396D，E，F)，并建议酶切时加入BSA达0.1mg/ml。

10)星活力是什么?

星活力是指在保温条件改变，如NaCl过多存在于反应液中，使酶切的核酸序列不同于它特定的识别序列。

11)什么是同切酶?

同切酶指两个酶的识别位点和酶切位点相同，如SphI(CGTAC'G)和BbuI(CGTAC'G)互为同切酶。

12)什么是neoschizomer?

Neoschizomer指两个酶的识别序列相同，但酶切位点不同，如SmaI(GGG'CCC)和XmaI(G'GGCCC)互为neoschizomer。

13)基因组规格指的是什么?

基因组规格的酶适用于酶切包裹在琼脂中的基因组DNA。另外，染色体DNA的制备、酶切和凝胶分离的条件对基因组规格的酶作了优化。

14)如果一个限制性内切酶不是基因组规格，是否表明它不能用于处理染色体DNA?

不一定。如果一个限制性内切酶不是基因组规格,Promega公司没有测试它能否处理包裹的基因组DNA。因此需作一些测试来决定酶是否会切割底物。

15)需要用多少单位的限制性内切酶对琼脂包裹的染色体DNA进行酶切?

切割包裹的DNA比普通底物需要更多的酶，一般需要多2倍。

16)什么是蓝/白克隆测试?

蓝/白克隆测试是一种确定酶切样品中，存在的少量外切核酸酶活力的质量检查过程。通过测定一个功能基因(Beta-半乳糖苷酶)酶切和重新连接后，蓝/白斑的比例，来确定外切核酸酶活力。如果存在少量外切核酸酶活力，或不存在外切核酸酶活力，得到的是蓝色菌落。

产生粘性末端的酶实验产生的白色菌落应小于2%，而产生平头末端的酶实验产生的白色菌落应小于5%。这个方法的灵敏度很高，可以检测出缺失一个碱基的酶切末端。

17)限制性内切酶是如何命名的?

限制性内切酶命名的次序如下：

A) 用3个字母代表来源的生物(如Bam代表 Bacillus amyloliquefaciens)

B) 1个字母或阿拉伯数字代表菌株(BamH)

C) 1个罗马字母代表发现或鉴定的次序(BamHI)

18)如何稀释限制性内切酶?

如果1小时内会使用限制性内切酶，可用补充有0.5mg/ml BSA的1X反应液稀释，如果在更长的时间内才会使用限制性内切酶，用酶贮存液稀释。