荧光素半抗原标记探针

非放射性物质标记核酸探针的方法通常是通过在核酸分子中引入诸如半抗原、生物素等惰性小分子。这些小分子一般通过连接到dUTP等核苷三磷酸上。这种经修饰的核苷三磷酸再通过酶促反应掺入到探针中，例如用于随机引物法标记长链探针或是通过末端转移酶标记寡核苷酸的3′端。

杂交后用与一种酶相连接的抗体（或者如果是生物素，则用链霉抗生物素蛋白streptavidin）来检测，这些酶如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶是用来催化所检测反应的。可使用的半抗原很多，最常用的是地高辛、生物素与荧光素。

本法比直接酶标法步骤更多，因为其中包括膜的封阻、抗体的结合及膜的洗涤等额外操作，但它可用在通过碱性磷酸酶催化底物二氧杂环烷（dioxetane）的高灵敏度化学发光检测上，还能用于寡核苷酸探针上，即通过偶联在探针上的辣根过氧化物酶催化的强化化学发光进行检测，具有低本底与快速光输出特点。

荧光素作为半抗原用于核酸标记探针有以下优点：

①荧光素在杂交中很稳定，甚至在较高温度下也是如此。

②荧光素核苷三磷酸可在DNA聚合酶作用下掺入到探针中去。

③针对结合物中的荧光素部分可以制备高亲和力的抗体。

④标记的探针不用纯化，因为当使用适当的封阻剂时，这种探针与膜的亲和力很低。

⑤使用本系统时被抗体识别的内源性物质干扰的机会很小，但在原位杂交中如使用生物素则有干扰

⑥荧光素用作半抗原的最后一个重要优点是，在杂交开始之前就可知道探针标记反应能否成功，即通过快速（20 min）透射测定法测定所发出的天然荧光。监测探针标记的进程与用β-计数器对32P标记的探针检测相似。

荧光素基因显影系统（fluorecein gene image system, Amersham International, Bucks, UK）就是利用荧光素作为半抗原，通过碱性磷酸酶催化二氧杂环烷的化学发光反应进行检测。通过大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段来催化的随机引物标记反应使荧光素-11-dUTP掺入到DNA链中。

在这个反应中，Klenow片段特别有效，所以标记过程可认为是一个净合成过程。例如50 ng的探针经1 h合成后可行到300 ng的探针。标记的探针不经纯化即可直接用于杂交试验中（先进行变性处理）。杂交的严格性可通过杂交过程中盐离子浓度或温度的调节来控制，或/和通过严格性洗涤来控制。

所推荐的探针浓度与ECL直接标记系统相同：目标DNA较少时使用10 ng/ml的浓度；目标DNA较多时使用2~5 ng/ml的浓度。

如果在杂交阶级中以及在随后加入抗体结合物前的膜封阻步骤中使用的是固体封阻剂，就可能因封阻剂难溶而造成程度不等的背景。使用封阻剂浓缩液可保证试剂的一致性和低本底。对抗体结合物制备进行优化及使用抗荧光素的单克隆抗体可进一步降低本底，提高信噪比。