血红蛋白电泳（hemoglobin electrophoresis）

实验原理

血红蛋白电泳（hemoglobin electrophoresis）目的是检出和确认各种正常和异常的血红蛋白。

根据不同的血红蛋白带有不同的电荷，等电点不同，在一定的pH缓冲液中，血红蛋白的等电点小于缓冲液的pH时带负电荷，电泳时在电场中向阳极泳动，反之，Hb带正电荷向阴极泳动。

在一定电压下，经过一定时间的电泳，不同的血红蛋白所带电荷不同，分子量不同，其泳动方向和速度不同，可分离出各自的区带，同时对电泳出的各区带进行比色或电泳扫描，可进行各种血红蛋白的定量分析。一般最常用的是pH8.6醋酸纤维薄膜电泳。

胞浆内存在糖原或多糖类物质（如粘多糖、粘蛋白、糖蛋白、糖脂等）中的乙二醇基（CHOH-CHOH）经过碘酸（periodic acid）氧化，转变为二醛基（CHO-CHO），与雪夫(Schiff )试剂中的无色品红结合，形成紫红色染料而沉积于细胞内多糖所在处。该反应称为过碘酸-雪夫(PAS)阳性反应，以前也称为糖原染色。

实验方法

材料：

1. 缓冲液

（1）pH8.6 TEB缓冲液：称取Tris10.29 g，EDTA 0.6 g，硼酸3.2 g，加蒸馏水至1000 ml。

（2）硼酸盐缓冲液：称取硼砂6.87 g，硼酸5.56 g，加蒸馏水至1000 ml。

2. 醋酸纤维薄膜、电泳仪、加样器、分光光度计、比色杯。

方法：

1. 血红蛋白溶液的制备

取肝素或者枸橼酸钠抗凝血3 ml，2000 rpm离心10分钟后弃去血浆；用生理盐水洗涤红细胞三次（750 rpm，离心5分钟），再2200 rpm，离心10分钟，弃去上清液；加入等量的蒸馏水；再加入0.5倍体积四氯化碳，用力振摇5分钟，2200 rpm，离心10分钟后将上层Hb液吸出备用。

2. 浸膜

将醋酸纤维薄膜剪成3 cm×8 cm的纸条，浸入pH8.6 TEB缓冲液，浸透后取出，用滤纸吸干。

3. 点样

用加样器取血红蛋白液10 μl，然后垂直点样到醋酸纤维膜上（毛面），距边缘1.5 cm处。

4. 电泳

将硼酸盐缓冲液作为电泳缓冲液倒入电泳槽中，将点样后的醋酸纤维膜放于电泳槽架上，点样在阴极端，200 V，30分钟。

5. 洗脱

分别剪下HbA、HbA2，放入试管内，分别加入蒸馏水15 ml和3 ml，轻轻振荡，待血红蛋白完全洗脱后，混匀。

6. 比色

洗脱液用蒸馏水空白调零，415 nm测定吸光度。

7. 计算

HbA2(%)=HbA2管吸光度/（HbA管吸光度×5+ HbA2管吸光度）×100%

实验结果计算

pH8.6 TEB缓冲液醋酸纤维电泳参考范围：HbA>95%，HbA2 1%-3.1%

注意事项

1. 电泳时间不能太长,电泳时醋纤膜不能变干,故应观察到HbA和HbA2清晰分开就停止电泳,电泳时间太长区带反而扩散模糊；

2. 点样量不能太多,如血红蛋白液太多，色带易脱落或染色不透，可出现HbA相对增高的假阳性结果；

3. 避免醋酸纤维膜被蛋白质污染；

4．电流不应过大，否则血红蛋白分不开带；

5．应同时做正常人和必要的已知异常血红蛋白的标本对照。