酵母RNA的水解及其组成成分的鉴定

【目的和要求】

1. 了解从酵母中提取 RNA 的原理和方法。

2. 了解定性鉴定核酸的原理和方法。

【实验原理】

酵母含RNA 达2.67—10.0%，DNA 则少于0.03—0.516％。为此，提取RNA多以酵母为原料。 稀碱法使用稀碱（本实验用0.2% NaOH溶液）使酵母裂解，然后用酸中和, 除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀 RNA 。由此得到的 RNA为变性的RNA，可用作制备核苷酸的原料。

用硫酸水解 RNA 后,可生成磷酸、戊糖和碱基,各成分用以下反应加以鉴定：

（1）磷酸与钼酸铵 试剂 作用可生成黄色磷钼酸铵 [(NH) ₃ PO ₄ ·12MoO ₃ ]沉淀。

（2）核糖与地衣酚 试剂 作用呈鲜绿色。脱氧核糖与二苯胺试剂反应生成蓝色化合物，而核糖无此反应。

（3）嘌呤碱与硝酸银反应可生成白色的嘌呤银化物沉淀。

【实验试剂和器材】

（一）试剂

酵母粉，0.2％氢氧化钠，乙酸，95％乙醇，无水乙醚，10%硫酸，浓硝酸，0.1N 硝酸银，1N 氨水。

酸化乙醇：100ml 95%乙醇，加1ml浓盐酸，pH<5.4。

钼酸铵试剂：将2g钼酸铵溶解在100ml 10% 硫酸中。

地衣酚试剂：100ml浓盐酸加入100mg三氯化铁，摇匀，贮存备用，使用前加入476 mg地衣酚。

二苯胺试剂：将4g二苯胺溶于400ml冰醋酸中，再加入11ml浓硫酸（比重1.84）。若冰醋酸不纯，试剂呈兰色或绿色，则不能使用。

（二）器材

试管，试管架，移液管，滴管，烧杯，锥形瓶，表面皿，漏斗，量筒，三用水箱, 离心机 ，抽滤装置。

【实验方法】

（一）酵母 RNA 提取

称取4克干酵母粉，放入100毫升烧杯中，加入40毫升0.2％氢氧化钠。在沸水浴中加热30分钟，常搅拌。冷却后，3800rpm离心15分钟。取上清液，加30ml酸化乙醇，搅拌，静置5分钟。然后3000转离心15分钟。弃上清，保留沉淀，沉淀即为粗RNA。

（二）RNA 的水解

向 50ml 锥形瓶中加入 0.1-0.2 克粗酵母 RNA 和 10% H ₂ SO ₄ 15ml 。沸水浴 20 分钟后，3800rpm离心5分钟，取上清液进行下列实验。

（三）组分鉴定

1. 磷酸的检验

取 2ml 上清液放入 1 支 试管 中加入 5 滴浓 HNO ₃ 和 1ml 钼酸铵试剂后，在沸水浴中加热，观察有无黄色磷钼酸铵沉淀产生。

2. 戊糖的检验

取 2 支 试管 ,各加入 1ml 滤液,分别加入等体积的地衣酚试剂和二苯胺试剂,在沸 水浴 中加热10-15 分钟。比较两支 试管 的颜色,并解释。

3. 嘌呤碱基的检验

取 1 支 试管 , 加入 1ml 0.1N AgNO ₃ 溶液, 再逐滴加入 1N 氨水至沉淀消失。然后加入 1ml 滤液, 放置片刻，观察有无白色嘌呤银化物沉淀产生（见光变为红棕色）。

【注意事项】

1. 用乙醇、乙醚清洗RNA时应用玻棒小心搅动沉淀，抽干，可得白色RNA粉末。