异常血红蛋白（abnormal hemoglobin）筛查

[实验目的]

1. 学习血红蛋白电泳分离方法；

2. 能辨认正常人和异常血红蛋白的电泳图谱；

[实验原理]

血红蛋白是一种结合蛋白质，由血红素和珠蛋白组成。正常人所含珠蛋白的多肽链有a、b、d 、e、g和z六种。这六种肽链的基因在人体发育的不同阶段表达状况不一。

正常成人红细胞中有三种血红蛋白即HbA、 HbA2 和 HbF。HbA（a2b2）是正常成人红细胞中的最主要的血红蛋白，占红细胞内血红蛋白总量的96%以上，PI=6.7。 HbA2(a2d2) 是正常成人红细胞中的次要成分，占2~3% 左右，其PI>6.7。 HbF(a2g2)为胎儿血红蛋白，胎儿出生后六个月急剧持续下降至血红蛋白总量的1%以下，其PI接近 6.7。

各种血红蛋白在pH8.5的缓冲液中均带负电荷在电场中都向阳极移动，但因等电点不同所带电荷数目不同而有不同的电泳速度。HbA因其所带电荷最多故向阳极泳动速度最快，又因其含量最多区带颜色最深。其后有一较浅的区带为HbA2，HbF与HbA的等电点接近，通常与HbA分不开。

异常血红蛋白是指由于基因突变而导致结构异常的红蛋白。异血红蛋白具有与正常血红蛋白不同的电泳行为，因此用电泳的方法可以将其检出。例如HbS是一种由b-链第6位的谷氨酸被缬氨酸所替换而形成的异常血红蛋白，此变异体比HbA少带两个负电荷，因此，向阳极移动的速度比HbA慢，出现于HbA与HbA2之间。

分析血红蛋白的电泳方法有许多，如滤纸电泳，淀粉胶电泳及聚丙烯酰胺凝胶电泳等。但异常血红蛋白筛查最常用的还是醋酸纤维薄膜电泳法。因为醋酸纤维薄膜做支持体电泳操作简便，电泳速度快，分辨力强区带集中而且对染料不吸附，容易定量。用醋酸纤维素薄膜电泳筛查异常血红蛋白的检出率为1~2‰。

[器材与试剂]

1. 器材、电泳仪、电泳槽、醋酸纤维素薄膜

2. 试剂

(1) 浸泡醋酸纤维膜TBE缓冲夜(pH8.5)；

(2) 电泳槽硼酸缓冲液(pH8.6；

(3)丽春红染色液；

(4)漂洗液。

[步骤与方法]

1. 浸膜：将醋酸纤维素薄膜膜面向下放入浸膜液中，浸透后用眼科镊子压入液面底部。

2. 采血：碘伏消毒耳垂部，用一次性采血针采血，并将血液吸在两次对折的滤纸尖部。

3. 加样：将浸泡好的醋酸纤维素薄膜膜面向上放在滤纸上，用滤纸吸去多余的液体，在距一侧1.5cm处用沾血的滤纸涂圆点状（直径约0.2cm）或线状。

4. 电泳：将加好样的醋酸纤维素薄膜膜面向下放入电泳槽中的缓冲液纱布上，加样端放在负极，静置2分钟后开启电源，调电压200伏，电泳40分钟。

5. 电泳结束后，关掉电源，观察电泳图谱，并记录红色区带（几条）及分布（位置）情况。

6. 染色： 将醋酸纤维素薄膜放入染色液中2分钟，然后转入漂洗液中洗至背底呈白色，再观察结果。

含异常血红蛋白的样品：应在未染色前观察，除正常成分外，在任何位置出现的不经染色的红色区带，均可记为有异常血红蛋白存在。异常血红蛋白常以HbA为标准，分为快泳血红蛋白和慢泳血红蛋白。

[注意事项]

1. 醋酸纤维素膜一定要浸透（无白色斑点），加样前从浸膜液中取出，既要吸去多余的液体还不能使膜太干，否则都会影响电泳结果。

2. 加样时注意要加在醋酸纤维素的膜面，电泳时也要膜面向下放到电泳槽中的缓冲液纱布上。