原代细胞分离培养鉴定以及检测等整体课题服务

Case：新生SD大鼠原代心房肌细胞分离与药物刺激培养冰检测相关蛋白与基因

实验设计

一、细胞：分离大鼠原代心房肌细胞

二、细胞培养分组：

a)对照组：正常大鼠原代心房肌细胞72h培养

b)高糖72h培养

c)高糖+氧化应激抑制因子72h培养

d)正常培养48h+氧化应激刺激因子再培养24h

e)高糖培养48h+氧化应激抑制因子再培养24h

f)正常培养48h+（氧化应激刺激因子+氧化应激抑制因子）共同培养24h

三、蛋白检测：WB检测各组培养细胞中A蛋白与B蛋白的表达。

四、荧光定量检测：荧光定量PCR方法检测各组培养细胞中A基因与B基因的表达。

实验报告

一、新生SD大鼠心房肌细胞的分离与培养：

1、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次，最后将组织剪成1mm3左右大小；

2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 胰酶和0.1% I型胶原酶），混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化 后4℃放置；

3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织完全被消化；

4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养；

5、差速贴壁1h后，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养；

二、新生SD大鼠心房肌细胞的α-actin免疫荧光鉴定：

1、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；

2、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min；

4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗（Abbioscience公司），然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜；

5、PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗（嘉美生物公司）， 37℃条件下放置1h；

6、用PBS冲洗3次，每次10min，最后在倒置荧光显微镜(Leica公司)下观察图像并拍照。

200×

400×

三、Real-time PCR检测SD大鼠心房肌细胞CaMK-Ⅱδ、A基因、B基因、FKBP12.6 mRNA表达水平

1、总RNA的提取：

（1）将细胞培养液吸出后，用PBS洗细胞2次，加入1 mL Trizol室温裂解细胞5min，用移液器均匀吹下细胞并置于EP管中，上下轻柔颠倒10次，室温静置5min；

（2）加0.2 mL氯仿，颠倒混匀10次，室温静置5min，4℃，12000rpm，离心20min；

（3）转上层水相于另一新EP管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀10次，-20℃放置2h后，4℃，12000rpm，离心15min；

（4）用移液器小心吸弃上清，加冰预冷的75%乙醇，4℃，12000rpm，离心10min；

（5）弃上清，EP管倒扣，空气干燥10 min；

（6）将总RNA溶于适量DEPC处理水中，最后用分光光度计测量其浓度。

2、第一链cDNA合成（Genecopoeia试剂盒）

（1）反应体系（20μL）：

Total RNA 2μg

Oligo (dT)18 1μL

10mM dNTPs 1μL

5×RT Buffer 4μL

Ribonuclease Inhibitor 0.5μL

TransScript RT 1μL

ddH2O to final volume 20μL

（2）轻轻混匀后，进行：

a) 42℃孵育30min.

b) 85℃孵育5min.

c) -20℃，保存备用.

3、Real-time PCR（Genecopoeia SYBR Green I 荧光染料试剂盒）

（1）引物序列：

a、CaMK-ⅡδF：CTGGCACACCTGGGTATCTT

CaMK-ⅡδR：ATCCCAGAAGGGTGGGTATC

b、A Gene F：TAACCTACCAGGCCGTGGAT

A Gene R：GCTGCGATCTGGATAAGTTCAA

c、B Gene F：GCAGTTGACTGAGGCGTCTT

B Gene R：GGATTCGTGAGTGGCGATAC

d、FKBP12.6 F：CTGGAATTCATGGGCGTGGAGATCGAG

FKBP12.6 R：GACTCGAGTCACTCTAAGTTGAGCAGCTC

e、β-actin F：GACGGTCAGGTCATCACTATCG

β-actin R：ACGGATGTCAACGTCACACTTC

（2）反应体系（25μL）：

F引物 0.5μL

R引物 0.5μL

SuperMix 12.5μL

Passive Reference Dye 0.5μL

cDNA 2μL

ddH2O 9μL

（3）程序设置如下（Eppendorf PCR仪）：

95℃ 3min

95℃ 20s

55℃ 20s 40循环

72℃ 20s

95℃ 15s

60℃ 15s

60℃-95℃ 20min

95℃ 15s

（4）Realplex软件导出数据并分析

CAMK-II基因

A基因

B基因

FKBP 12.6基因

四、WB检测新生SD大鼠心房肌细胞CaMK-Ⅱδ、A蛋白、B蛋白、FKBP12.6蛋白表达水平

1、实验材料

PBS、细胞裂解液、PMSF、BCA试剂盒（嘉美生物）、5×蛋白上样缓冲液、脱脂奶粉，CaMK-Ⅱδ一抗（Abbioscience）、B蛋白一抗（Abbioscience）、FKBP12.6一抗（Abbioscience）、β-actin一抗（Abbioscience）和B蛋白一抗 (Millipore)、山羊抗兔-HRP二抗(abcam)、ECL Reagent（嘉美生物）、显影剂、定影剂。

2、实验仪器

细胞刮、1mL注射器、EP管、移液器、冷冻离心机、摇床、酶标仪、电泳器材、PVDF膜、电转器材、X光片、压片盒。

3、实验方法

（1）细胞裂解液配制：基础裂解液中加入0.2mmol/L PMSF蛋白酶抑制剂。

（2）蛋白样品制备：

①弃去六孔板细胞中的培养基。

②每孔细胞中加入2mL 4℃预冷的PBS，平放轻轻摇动2min洗涤细胞，然后弃去PBS洗液。重复以上操作。

③每孔加入100μL细胞裂解液在冰上对细胞进行裂解，然后用细胞刮将细胞刮下，最后将裂解液移入干净的EP管中。

④将EP管中细胞冰上裂解30min，在此期间用1mL 注射器对裂解液进行反复抽吸20次。

⑤裂解完后，于4℃，12000rpm离心20min。然后将上清移入新的1.5mL EP管中，即为所需蛋白样品。

⑥每样本取3μL 蛋白提取液转入另外的EP管保存备定量用。向其余蛋白样品中加入其1/4体积的蛋白上样缓冲液，沸水煮5min，最后将其－80℃保存。

（3）蛋白浓度测定：

根据嘉美生物BCA试剂盒说明书中步骤进行实验。具体步骤如下：

①将0.5μg/μL 蛋白标准品按0、1、2、4、8、12、16ul加到96孔板中，然后将各孔用细胞裂解液补足到20μL。

②每样品加2μL 到96孔板的样品孔中，然后将各孔补加18μL 的细胞裂解液。

③各孔加人200μL BCA工作液（BCA试剂A: BCA试剂B=50: 1），37℃条件下放置30min。

④用酶标仪测定562nm波长处各孔的吸光度。最后根据标准曲线计算蛋白浓度。实验结果见后面结果部分内容。

（4）SDS-PAGE电泳：

①配胶：CaMK-Ⅱδ（1.5mm 10%分离胶, 5%浓缩胶）、A蛋白、B蛋白（1.5mm 5%分离胶，4%浓缩胶）、FKBP12.6（1.5mm 15%分离胶，5%浓缩胶）

②上样：取制备好的蛋白样品，使用前沸水煮5min，12000rpm离心2min。各样本之间平衡后，每泳道上样45μL。

③电泳：浓缩胶60V，分离胶100V，溴酚蓝移动至玻璃板底端，提示电泳结束，关闭电源。

（5）转膜：

①将PVDF膜放到甲醇中浸泡2min，然后把转膜海绵垫、滤纸、PVDF膜放置于电转液中平衡30min。

②将转膜夹打开，在代表负极的黑色面铺上一块湿润的海绵垫，再添加2层湿润的滤纸，将电泳好的SDS-PAGE分离胶小心地铺在滤纸上方，表面再覆盖大小合适的PVDF膜；然后再覆盖两层湿润 滤纸，再垫上湿润的海绵垫，最后将转膜夹的红色面与黑色面闭合好，将其放入转膜槽中相应的位置。

③转膜CaMK-Ⅱδ（100V，60min）；A蛋白、B蛋白（100V，180min）；FKBP12.6（80V，30min），转膜全过程在冰上进行。

④丽春红染色：转膜完成后，将膜从转膜夹中取出，立即投入丽春红染液中染色，大约染色3min 后将膜从丽春红染液中取出，用DDH2O轻轻冲洗膜，注意观察膜上的红色条带，当条带足够清 晰后停止水洗，根据蛋白Marker位置适当剪膜，留出目的蛋白所在的范围。最后用DDH2O彻底洗膜，尽可能洗去残留的丽春红染料。

（6）封闭：室温条件下，5%脱脂奶粉+TBST在摇床上封闭1h。

（7）一抗杂交：

CaMK-Ⅱδ（1:500）、A蛋白（1:200）、B蛋白（1:50）、FKBP12.6（1:300）、β-actin（1:1000），4℃孵育过夜。

（8）洗膜：TBST洗膜3次，每次10min。

（9）二抗杂交：山羊抗兔-HRP二抗（1:2500），室温孵育1h。

（10）洗膜：TBST洗膜3次，每次10min。

（11）显影：

首先，用滤纸吸去膜上的液体，将膜平放于保鲜膜上，将新鲜配置好的ECL Reagent滴加到膜面上，反应3min后用滤纸在膜的边缘尽量吸去多余的ECL Reagent，然后根据条带的亮度将膜放到 压片夹中曝光适当的时间，最后，显影、定影、冲洗胶片及对胶片进行扫描分析。

BCA试剂盒蛋白定量实验结果：

标准品OD值分别为：0.488、0.519、0.559、0.603、0.668、0.759、0.884

LG组、NG组、HG组、HG+U组OD值分别为：0.646、0.677、0.671、0.698

ONOO组、DC-ONOO组、ONOO+U组OD值分别为：0.816、0.703、0.79、0.612

WB实验结果：