免疫胶体金技术及其在兽医临床上的应用

摘 要：免疫胶体金技术是20世纪80年代发展起来的一种新型免疫标记技术，应用该技术制成的胶体金试纸条具有简便、快速、灵敏、特异性高等优点。文章介绍了胶体金技术的基本原理、制备方法、胶体金技术的特点以及利用该技术制成的胶体金试纸条在兽医临床上的应用。

关键词：胶体金；兽医临床；应用

免疫胶体金技术在人类医学上是一种常用的免疫标记技术，有其独特的优点。近几年来在生物医学各领域中得到了日益广泛的应用。

目前该技术在医学检验中的应用主要是胶体金快速免疫层析法(colloidal gold enhanced immunochronmtography assay， CGEIA)和快速斑点免疫金渗滤法(dot-immunogold filtration assay， DIGFA)，用于检测人类乙肝表面抗原、人绒毛膜促性腺激素、艾滋病病毒等。

近几年随着该技术的不断发展，已在兽医临床上得到了广泛应用，具有简便、快速、灵敏、特异性高和无污染等优点。

一、胶体金的制备及基本原理

1、 胶体金的发现

1857年，法拉第用还原法从氯金酸水溶液中制备胶体金，并发现在其中加入少量电解质后，可使胶体金由红色变为蓝色，最终凝集成无色，而加入明胶或其他大分子物质便可阻止这种变化，他的重大发现奠定了胶体金制备和应用的科学基础。

直至1971年Faulk W P等[1]将胶体金引入免疫化学，此后免疫胶体金技术作为一种新的免疫学方法，在生物医学领域得到了日益广泛的应用[2-3]。

2、胶体金的制备

胶体金是通过在氯金酸水溶液中加入还原剂使之还原并聚集形成胶体金粒子而形成的。使用不同种类、不同剂量的还原剂，可以控制所产生的粒子大小，即粒子的大小取决于反应溶液中最初还原试剂和还原核的数量。

还原剂浓度越高，核浓度也越高，氯金酸水溶液的还原也就从更多的还原中心开始，因此产生的胶体金粒子数量越多，体积也越小。粒子直径每增加1倍，数量减为原来的1/8.目前，制备胶体金的方法有许多种，根据时间的先后，依次为抗坏血酸还原法、柠檬酸三钠还原法、乙醛超声波还原法、放射性胶体金法、硼氢化钠还原法、鞣酸-柠檬酸三钠还原法、白磷还原法及白磷还原法的改良法和微波制备胶体金法。

根据不同的制备方法，可以制备出直径1 nm～500 nm的胶体金粒子，但作为免疫标记探针，其直径一般在3 nm～50 nm的范围内。

3、免疫胶体金技术的基本原理

免疫胶体金标记技术是以胶体金作为示踪标志物，应用于抗原抗体反应中的一种新型免疫标记技术。胶体金颗粒之间因静电作用形成一种稳定的胶体状态，也称金溶胶。胶体金标记就是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。

吸附机理是胶体金颗粒表面的负电荷与蛋白质的正电荷基团静电吸附而形成牢固结合。用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径，也就是不同颜色的胶体金颗粒。

这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附功能，可以与葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽等非共价结合，因而在基础研究和检验检疫中成为非常有用的工具[4]。

免疫胶体金颗粒具有高电子高密度的特性，在显微镜下金标蛋白结合处，可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而可用于定性或半定量的快速免疫检测。

4、免疫胶体金快速检测技术

目前医学检验中应用的免疫胶体金快速检测技术主要有CGEIA和DIGFA两种方法。

这两种方法都是以微孔滤膜为载体，包被已知抗原或抗体，加入待检标本后，经滤膜的毛细管作用或渗滤作用使标本中的抗原或抗体与膜上包被的抗体或抗原结合，再用胶体金结合物标记而达到检测目的。

（1）DIGFA DIGFA于1989年由Spielberg F等[4]建立，该体系充分利用了微孔滤膜吸附蛋白质的优良特性、渗滤装置独特的设计以及胶体金作为标记物的种种优点，使得抗原或抗体不仅能与膜上的抗原或抗体快速结合，还能有效的浓集于膜上加快免疫反应，胶体金瞬时显色报告检测结果。该方法特别适合于抗体的检测。

（2）CGEIA CGEIA是20世纪90年代初在免疫渗滤技术的基础上建立的一种简易快速的检测技术，由Beggs M等[5]最先用于人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadothphin，HCG)的测定。

免疫层析条主要由玻璃纤维膜、金标垫、硝酸纤维膜，纤维膜组成，将4种膜从底部向上按顺序粘在支持物上并切成条即成。检测时，只需将层析条插入待检液中，平放在桌面上，5 min后观察结果即可。试验原理以最常用的双抗体夹心测抗原为例。

当将层析条插入待检液中进行检测时，含有待测抗原的液体从免疫层析条的底部被吸收后迅速与金标探针(Ab1-Au)发生抗原抗体反应，形成的抗原抗体复合物(Ab1-Au-Ag)通过毛细作用被运送到上面的硝酸纤维膜上，复合物接着与硝酸纤维膜上的抗体发生反应，形成另一个复合物(Ab1-Au-Ag-Ab2)而富集在检测区。

由于胶体金自身显色而形成红色的质控线。该方法由于简便、快速、特异性、敏感性好，结果直观等优点，得到了空前广泛的发展和应用。

与其他检测技术比较，应用免疫胶体金快速检测技术时，样品不需要特殊处理，试剂和样本用量极小，样本量可低至1 μL～2 μL；既可用于抗原检测，也可用于抗体检测，检测时间大大缩短，也不需荧光显微镜、酶标检测仪等贵重仪器，试验结果可长期保存。但该技术一般作为定性，不易定量，大批量的集约性的操作，不如ELISA快而方便[6]。

二、免疫胶体金检测技术的研究

目前，国内外销售的金标免疫快速试验的成品多达几十种，但大多数成品是来自于国外进口或国内分装，同国外相比，目前国内这一领域的研究仍处于起步阶段，国内还没有国产材料制成的成型产品。

由于金免疫结合试验的产品市场巨大，要在国内开展这一领域的研究，应尽快在国内建立起一套完整的工艺，研制出多品种、高质量的金标快速检测产品。金标试剂盒发展的方向主要体现在以下几个方面：

1、进一步提高检测灵敏度

金标免疫快速试验的灵敏性与ELISA基本相近，许多试验的敏感度都可达到1 ng/mL或更低水平，但是有些试验则不能达到如此的敏感度，灵敏度的提高无疑会拓宽胶体金免疫检测技术的检测范围。采用信号放大系统如生物素-链亲和素系统，应用链亲和素与生物素结合的四价性和极高的亲和常数，可明显提高灵敏度和稳定性[7]。

2、实现检测多元化

在同一膜上固定多种反应物，一次测定可同时得到一组结果。这对于检测某些具有联检意义的物质具有很大的应用价值。如乙型肝炎表面抗原、艾滋病病毒(Hmuan immunodeficiency virus，HIV)抗原和抗体(抗HIV/HIV-P24)以及丙型肝炎抗体的检测组合对筛选献血者会更为方便。弓形虫、巨细胞病毒和风疹病毒等抗体的检测在围产期检查中极为有用。

3、实现半量或定量检测

胶体金免疫测定时，当标本中受检物浓度超过试剂的敏感度时出现显色的阳性反应。这种测定较适用于检测正常体液中不含有的或含量极低而疾病时明显升高的物质，例如感染性疾病病原体的抗原或其相应抗体，妊娠时尿液中HCG等。

在测定一般正常体液中存在而在疾病时升高的物质，若单纯以超过正常参考值上限为阳性界限，往往不能满足临床需求。

虽然不论是DIGFA还是CGEIA，阳性显色的深浅与标本中受检物的浓度有一定的相关性，但由于试剂的原料和制作工艺很难使每一份试剂性质相同，因而同一浓度的受检物在各份试剂的显色深浅不尽相同。因此，如何实现半量或定量检测尚待进一步研究。

3 免疫胶体金技术在兽医学中的应用

（1）免疫胶体金技术在禽病诊断中的应用

随着世界范围内养禽业的规模不断扩大，禽病对养殖的危害也随之加剧。对家禽疾病进行有效防治的关键是快速准确地进行诊断并弄清致病因子。伴随着病原检测技术的进步，免疫胶体金技术以其快速、简便、可单份检测、灵敏度高、特异性强、稳定性好、检测标本种类多等优点开始被逐渐应用于禽病的病原诊断[8]。

郝桂兰等[9]利用免疫胶体金试验，采取病死鸽棉拭子样品30 min内即完成对一发病鸽群的快速鉴别诊断，排除禽流感病原，通过进一步的鉴定，结果该鸽群患的是禽Ⅰ型副黏病毒病。

王长美等[10]用免疫胶体金试验诊断一发病率高、死亡快、疑似禽Ⅰ型副黏病毒感染的鹅病例，结果为禽流感阴性，根据临床症状和病变情况、免疫胶体金试验以及病毒分离和鉴定，证明该鹅群患禽Ⅰ型副黏病毒病，实现了对禽Ⅰ型副黏病毒病的快速鉴别诊断。王爱华等[11]选择15 nm的胶体金颗粒作为标记物，制备了鸡减蛋综合征病毒(Egg drop syndrome virus， EDSV)胶体金试纸条。

该试纸条能检出浓度约为1.35 μg/mL的纯化鸡减蛋综合征病毒。程安春等[12]应用银加强胶体金探针检测提纯的鸡减蛋综合征病毒(EDSV)抗原的最低检出量为0.117 19 μg/mL，以此法检测了人工感染的50只鸡采集的样本，对卵巢、输卵管峡部、咽喉部、软壳蛋的阳性率均为100%，粪便阳性率为92%。

王泽霖等[13]采用胶体金标记纯化的羊抗鼠IgG，建立了一种对鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)进行检测的银加强金标免疫技术(sliver-enhanced colloidal gold assay，SECGA)，SECGA检测抗原可用IBV早期检测，具有群特异性、快速、敏感、简便、结果易判定。

朱瑞良等[14]用免疫胶体金试纸膜进行快速检测传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)的研究，试验结果能够识别不同的IBDV毒株，包括强毒和弱毒，为IBDV的检测开辟了一条新的、快速的途径。

（2）免疫胶体金技术在家畜疫病诊断中的应用

郑鸣等[15]用胶体金标记抗原，运用双抗原夹心法于国内首先建立了猪瘟病毒抗体检测免疫层析试纸条。认为该方法操作简单、灵敏度高、特异性好，能区分强弱毒感染，适合猪瘟的临床诊断。刘春龙等[16]建立了检测牛初乳中免疫球蛋白( IgG) 含量的免疫胶体金法，并与常用的免疫单扩散法进行了比较。

结果表明，免疫胶体金法灵敏度为200 μg/mL，操作简单快速，不需要特殊仪器和设备，适合现场的快速检测。李恪梅等[17]用布鲁菌纯蛋白衍化物作为该检测板的包被抗原，建立了用胶体金标记抗原，利用间接法检测人和不同动物血液样品中的抗布鲁菌抗体的新方法。

（3）免疫胶体金技术在犬病毒病诊断中的应用

王中力等[18]采用柠檬酸三钠法制备胶体金颗粒，标记纯化的犬细小病毒(Canine parvovirus，CPV)单克隆抗体，在玻璃纤维素膜上喷加纯化的犬细小病毒多克隆抗体，制成诊断CPV抗原的快速诊断试纸条，并应用研制的CPV试纸条对收集到的120份犬粪便样品进行检测，其结果与血凝试验结果相比较，血凝效价在1∶40以上，试纸条均能检测为阳性。

该试纸条与犬瘟热病毒及犬传染性肝炎病毒无交叉反应，且试纸条保存6个月后，其检测结果重复性为100%。徐葛林等[19]采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒标记抗狂犬病病毒单抗，制成免疫层析试纸条。

结果表明，该诊断试纸条只与狂犬病病毒抗原有特异性反应，与乙型脑炎病毒、正常小鼠脑组织等均无交叉反应。该诊断试纸条与酶联免疫法(ELISA)试剂盒比较检测了48份可疑狂犬病犬唾液样品，两种方法的符合率为88.2%，认为该诊断试纸条非常适用于野外对动物脑或唾液中的狂犬病病毒抗原的检测。

三、结语

目前，兽医临床上许多病的检测方法仍较多地局限于传统的血清学方法，难以适应病原快速诊断的发展要求。近年来，免疫胶体金技术以其简便快速，特异性强、敏感性高，肉眼判读，实验结果易保存，无需特殊仪器设备和试剂等优点，被广泛应用在于兽医临床疾病诊断和检验检疫中。

随着胶体金新的标记物和制备方法的发展，免疫胶体金技术将会有更为广阔的应用前景。

参考文献（略）