从小鼠脾脏分离小鼠天然杀伤细胞
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基本方案:
由于所用Mab只能检测C57BL背景小鼠体内的NK1.1CD3- NK细胞,故本方案适用于C57BL/6或者C57BL/10(以及H2b 、d、q 同系小鼠)小鼠脾脏细胞。
清楚杂细胞所用的单克隆抗体的活性对本方案至关重要。单克隆抗体可以买到,并且其杂交瘤可以从ATCC得到,因此建议检测单克隆抗体的活性以保证实验成功。最佳补体和细胞浓度也需要通过实验确定。
实验材料:
1. C57BL/6或者C57BL/10小鼠
2. Tris/NH4Cl裂解缓冲液
3. HBSS/3%(V/V)FBS
4. 10×单克隆抗体储存液
5. GK1.5(ATCC号TIB207)、53-6.72(TIB105)、M5/114.15.2(TIB120)、J11d.2(TIB183;PharMingen)
6. 单克隆抗体MAR18.5(TIB216;PharMingen)浓度1mg/ml
7. 含酚红的HBSS(Life Technologies)/10%(V/V)FBS
8. 低Tox-M兔补体,无菌复溶
9. 淋巴细胞M密度梯度分离液(Accurate Chemical and Scientific),室温
10. RPMI-10完全培养基
11. FITC标记的抗CD3抗体和PE标记的PK136抗体(PharMingen)
12. 15ml和50ml带盖聚丙烯锥底离心管
13. Beckman CS-6R离心机(或同类离心机)
14. 血清学吸管
实验方法:
1. 处死小鼠,无菌取脾脏。
2. 制备脾脏细胞悬液,置于50ml离心管中,避免将纤维性杂质移入离心管。200g离心5min以洗涤细胞。采用“去除脾脏细胞悬液中的红细胞”的方法裂解红细胞,或使用Tris/NH4Cl裂解缓冲液。每个脾脏的细胞用1ml HBSS/3%(V/V)FBS混悬。
3. 用台盼蓝拒染法计数活细胞。用HBSS/3% FBS混悬细胞至5×107 个细胞/ml。置于冰上保存。
4. 制备下述单克隆抗体的10×混合溶液(10×每种抗体的饱和浓度):
GK1.5(抗CD4)
35-6.72(抗CD8)
M5/114.15.2(抗I-A和I-Ed,k )
J11d.2(抗CD24)
5. 每0.9ml细胞悬液加入0.1ml单克隆抗体混合液,4℃孵育30min。
6. 用冰的HBSS/3% FBS洗细胞2遍,4℃,200g离心5min,弃上清。用10ml冰的HBSS/3% FBS混悬细胞再洗一遍。将细胞用HBSS/10% FBS混悬至浓度5×107 个细胞/ml。
7. 加入10mg/ml抗大鼠κ(MAR18.5;1mg/ml储存液)和低Tox-M兔补体至细胞悬液使其达到最佳终浓度(通常1:6,但需要根据经验确定)。37℃孵育45min,每15min振摇一次。
8. 用HBSS/10% FBS洗一遍(步骤6)。
9. 用5ml HBSS/10% FBS混悬细胞。取少量细胞悬液采用台盼蓝拒染法计数活细胞,以确定补体裂解效果。
10. 将5ml室温的淋巴细胞M密度梯度分离液加入到一个15ml离心管中。将5ml细胞悬液轻轻加在分离液上。室温,200g离心20min,使离心速度缓慢下降。
11. 用吸管从界面小心吸取液体,放在另一个15ml离心管中。必要时可将界面放在白色背景前以便看清。用RPMI-10完全培养基洗2遍(方法同步骤6)。台盼蓝染色计数活细胞,备用。
12. 为检验细胞纯度,可加入终浓度为10mg/ml的抗CD3-FITC和PK136-PE(抗NK1.1)抗体,进行流式分析。
附录:
HBSS/10%(V/V)FBS和HBSS/3%(V/V)FBS:56℃ 45min热灭活FBS,过滤。取HBSS,加入不同量的FBS,分别配置含10%和3%(V/V)FBS的HBSS溶液。在10%FBS的HBSS溶液中加入酚红,而3%FBS的溶液不加酚红,以示区分。4℃可保存6个月。
大鼠补体,低Tox-M,无菌复溶:将冻干的低Tox-M大鼠补体(Accurate Chemical and Scientific)用无菌的HPLC级的纯水溶解,临用前配置。如需要,可以用0.45mm滤膜过滤除菌。滴定法测定每批次产品的细胞毒活性。记住始终置于冰上操作。冻存时迅速置入-70℃冰箱中,于-70℃可保存6个月。
Tris/NH4Cl裂解缓冲液:90ml 0.16mol/L(8.3g/L)NH4Cl;10ml 0.17mol/L Tris·Cl,pH7.65;用HCl调pH至7.2;过滤除菌;室温可保存3个月