293转染没有表达荧光

xuwenpku：用pTRACER转染293细胞，约70-80%汇合度，3μl lipo，2μg质粒，36h后没有表达荧光，请教可能是什么原因？另外，想问是不是lipofectamine转染，要求细胞必须是传代之后24小时以内的细胞？延长转染时间是否会有好处呢？

在另外，pTRACER这个质粒由那位同学用过么？它的荧光表达好不好？

丁香园网友guoguo1984428认为：

你可以用PEGFP系列转染试试，这些载体很不错的，还有你的293细胞代数是否太高啦?

丁香园网友huli317认为：

质粒我是没用过，但用293来包装扩增腺病毒，一般细胞传代后13~16小时就开始加病毒液，GFP稳定表达一般要等48小时，我一般是等72小时收集病毒，感染目的细胞也是细胞传代后16~20小时开始加病毒液，48小时后观察。虽说GFP稳定表达要在48小时候，但36小时还没看到荧光的话可能是转染不成功。

丁香园网友gexiaohu认为：

3μllipo可能太少了吧。我给楼主一个标准，每平方厘米的面积用1μl lipo 与1μl质粒。放置24小时。做实验不要省钱。多做几次不成功还不如一次成功哦。另：p-track-cmv这个质粒的荧光效果相当好。我做的话，转染效率基本是60%以上的荧光（24小时）。

至于传代的问题，根据我的经验，我通常是养好足量的细胞，然后胰酶消化，大量接种到6孔板中。一般25cm的falsk 95%融合度的细胞接种一块6-well plate。4小时后会完全贴壁，这个时候马上做转染，效果不错。个人的经验，见笑！

丁香园网友wangqiang007：

我一般转染液用Vigofect

丁香园网友jzygood认为：

各位大侠，也有同样的问题，我用pad tracke-cmv 和adeasy-1系统重组腺病毒，重组后的腺病毒ad-目的基因经过PAC I 酶切用脂质体转染细胞，包装重组体腺病毒，在转染前，我对Pac I酶切ad-目的基因证明是正确的（一条为30KB，一条为4.5KB），可是我转染过程中，每次在24h观察转染效率很高。

即有很多绿色荧光表达，但是随着时间的推移，荧光越练越少，细胞也没出现细胞病变现象，到12d－14天准备收毒时，已经没有荧光了，我曾想到是没有对PAC I 酶后的ad-目的基因纯化，但是仍然不能避免。

一位老师说有可能是padtrack-cmv上一个表达信号出了问题，建议我重新用另一实验室的padtrack-cnv和ADEASY-1同源重组，请问大侠们，我的问题出在那里？为什么只能瞬时表达，而不能稳定表达？？我需要重做么？是我收毒晚么？但是没有细胞病变啊！感激涕零多谢指教！◎