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    基本方案 高滴定度 HIV-I 基本载体转染 293T 细胞实验步骤

    相关实验：高滴定度慢病毒载体产物实验

    最新修订时间：

    材料与仪器

    293T细胞
    杜氏改良培养基 TE 缓冲液 CaCl2 2 X HeBS PBS 漂白剂
    乙醇喷壶 组织培养皿 培养箱 灭菌离心管 过滤器 组织培养瓶

    步骤

    1. 在 IOcm组织培养皿中用D M E M -10培养基培养293T 细胞， 37°C 培养箱10% C O 2 培养，每周3 次传代1 :4〜1 : 6 (如每个星期一、三、五） 。 2 . 转染前2 天，准备10个皿，每个皿中接种2X 106 个 293T 细胞， 37°C 培养箱10% C O 2 培养过夜，隔天早上将细胞1 : 2 传 代 成 2 0 个 IOc m 的培养皿中，加 IOm I D M E M -10培养基培养，再 W C 培养箱10% C O 2 培养过夜。 3. 用 p H 8. 0 的 T E 缓冲液调整所有质粒D N A (如 p M D . G 、 pRRL-C M V -GFP-sin、 pMDLgag/polRRE、 pRSVrev) 浓度成 lmg/ml。 4. 将 100卩 1p M D . G 、 400卩 1pRRL-C M V -GFP-sin、 240卩1pMDLgag/polRRE 和 6 0jul
    pRSVrev混合于I .5m l离心管中。 这4 i 而要 20 个狐。母个jm■需要 5哗 pMD. G， 20哗 pRRL-CMV-GFP-sin， 12哗 pMDLg/pRRE 和 3吨 pRSVrev。 5. 下午进行转染，加 2 1 0 4 去 离 子 水 到 ~次 性 L 5mi 离心管中，共 2〇个 再 加 i DNA 混合物打匀。 。丹 影 ¥ 6. 加 250^1 0. 5mol/L 的 CaCl2 到第5 步中的离心中混匀。 7. 加 25OW2XHeBS到 2〇个I 5mI 灭菌锥形离心管中，然后逐滴加人第6 步中的■ DNA/ CaCl2 混合物到离心管中，充分混勻。 8. 将制备的溶液室温放置3〇 min。 9•逐滴加第8 步中的溶液到20个 第 2 步中的培养皿中。轻轻混匀直到培养基呈现均勻 的红色。 10•将培养皿放置于5 % C〇2 培养箱中W C 过夜。隔天早上用10mi 新 鲜 D M E M _1〇换 液后， 37°C培 养 28h。 11•收集上清液到50m l离心管中盖上盖子，用 70%乙 醇 消 毒 后 带 出 无 菌罩。 4。 〇, 500g 离心 2min。 12. 连 接 125m l过滤器到真空泵，过 滤 i 〇〇 m丨培养基通过〇.45^m 的滤膜。用另外一个 过滤^ 过滤剩下的IOOml培养基。将过滤的溶液置于75cm2 组织培养瓶中。 13. 可选操作：取 Im I于 i .5m l离 心 管 中 （ 支持方案丨和2)，于 4° C保存备用。 滴足是随机的，当C lO 8T U A nl的时候最终滴定度很重要。这种情况下，就需 要确定步骤中的哪步没有达到最佳。第 1 3 步中的样品滴定度决定载体产品是否可 用。 离心后滴定度< l 〇6TU/m l或回收率< 50% 都存在问题。比 较 第 1 3 和 1 8 步中 的 载 体 颗 粒 数 目 （ 由计算第一次离心后得到回收率得出） ，在 离 心 前 计算颗粒回收 率和颗粒数目。颗粒数目是滴定度（ T U /m D 乘悬液 体 积 （ mD，详 见 表 12 6 工14.转移过滤的培养基到6 个 30m l 的灭菌异质同晶聚合物离心管中，将离心管放于 S W 2^转子中，盖上超速离心机槽后带出无菌罩。 16X：， 721〇吆 离 心 9〇 _ 。 15•打开高速离心机的罩子。用镊子小心将管子取出离心机。倒置管子以把上清液移入 一 75cm2 的组织培养瓶中。留少许上清液用来滴定（ 离心前病毒颗粒< 5 % 的应存 留在上清液中） 。在残留的上清中加入1/6体积的1 4 % 漂白剂，混匀，静置ih，去 除。保持管子倒置，并用纸巾拭净管壁，以尽量除尽上清液。用镊子夹取纸巾。不 要擦到管子的锥形底部。把空管子置冰上。加 600jUl的PBS。 16.用 Iml的 tip吹打20次以重悬载体沉淀，勿打起泡沫。置冰上3〇min。
    17. 再吹打20次。将 6 管中的重悬载体颗粒共同放入一个5m l 离心管中。加入适量 P B S 以充满管子。 一轮 离 心 即可为体外实验提供足够高的浓度。这样，载体颗粒被集中，分装入 0. 5ml 离 心 管 ，保 存 在 一 80°C。 18. 用 I% - D M E M -10稀释5^1载体重悬液。将其保存在4°C 直至用来滴定（ 支持方案 1 和 2)。 19. 76 000g ， 16°C高速离心9〇 min。打开离心机罩子。用镊子取出管子，在一 50m l 离 心管上倒置管子以去除上清液。留少许上清液用来滴定（ 离心前病毒颗粒< 5 % 的 应存留在上清液中） 。在残留的上清液中加入1/6体 积的1 4 % 漂白剂，混勻，静置 lh，去除。擦 拭 管 子 （ 第 15步)。在管底加21〇4的P B S 。 20. 用 Iml的 tip吹打20次以重悬载体沉淀，冰上孵育2h。重复吹打以完成重悬。 21•用495M1D M E M - 10稀 释 5/J 浓缩后的载体块。用 400^x1D M E M - 1 0 和 IOOjlJ 第一次 的稀释液混匀。将这些1 : 100和 1 : 500稀释的悬液保存在4°C以备用来滴定（ 支 持方案1 和 2)。用 第 13、 18和 2 1 步保存的液体计算复苏百分比（ 表 12. 6.1是病 毒纯化过程的典型结果） 。 22•将第21步获得的浓缩液分10管 ， 204/管。一80°C 储存。 支 持 方 案 1 滴 定 慢 病 毒 G F P 载 体 株 慢病毒载体的滴定程序很像其他载体（ 单 元 12. 7 和 12. 8 疱疹载体及单元12. 3 腺 相关病毒载体的滴定程序） 。有几个参数可以影响载体表现出的滴定度，如用于靶细胞 的细胞系、加入载体颗粒的培养基的体积、转染的持续时间以及有没有能帮助载体颗粒 附着于细胞表面的多聚阳离子。此程序可用于任何细胞系。但是，有的细胞系转染效果 较差，而且这里标TK的适用于H e L a 细胞的预期结果并不适用于所有细胞系。最好用 2M T 细胞替代H e L a 细胞，因为这种细胞系在实验室培养就是专门用来做细胞转染的。 然而，就 算 293T 细胞象H e L a 细胞一样转染效率高，它们的贴壁能力却较差。当然， 这不是G F P 检测的问题（ 支持方案1)，而 是 LacZ染色过程中应该特别注意的（ 支持 方 案 2)。不论如何，如 果 用 293T 细胞，在加入每种试剂时都必须特别小心地轻轻 吹打。 附 加 材 料 （ 基本方案） HeLa 细 胞 （ A T C C # CCL-2) 载 体 （ 基本方案） 0. 2 5 % 胰酶/0. 53mmol/L —E D T A (无染料. ； Life Technologies; 商业化 l〇 ，X 株 P B S 稀释） ' 6 孔组织培养板 荧光细胞分析仪（ F A C S ; BectonDickinson) 及适用的管子 1•滴定前一天，在 每 个 6 孔板的孔中，用 2ml D M E M - 10 准确接种0 •5X105 数量的 H e L a 细胞，并保证细胞平均分布于孔板底部。每种载体株准备一个孔板做滴定用。 37°(：， 1〇%(：0 2 孵育过夜。
    2•在5 个孔内，加入等量待滴定的载体液：用 5〇 y 和 25y 未稀释的液，及 1〇〇 ^ 、 5〇 4和 254按 1:50稀 释 的 液 （ 分别对应2.(^1、 1.(^1、 〇.5] ^的 未 稀 释 液 ） 。勿在 另一孔内转染细胞，做空白对照。 3 . 在 F A C S 分 析 前 ，去 除 培 养 基 ，用 2ml P B S 洗 一 次 ，加 入 50(^1无 色 胰 酶 z 〇 • 53mmd/L EDTA。孵育5min以消化细胞。用 Iml tip吹打以打裂凝块。将细胞转 至装有50〇4 P B S 的 FA CS管子里。 如需要，可将一份细胞保持于培养状态。如 F A C S 分 析 在 让 内 未 完 成 ， 可 以 用 4 乂 （ m /V〇 多聚曱醒■溶液（ 见配方） 固定细胞3〇 m in ，能 在 保 存 至 少 一 周 4•通过F A C S 分析确定G F P 阳性细胞比例。 5.以下面公式计算滴定度，单位为转化单位（ T U ) /ml: (IXlO5 接种细胞X % G F P 阳性细胞）X ]000 载体4 数 ^ 为了做和确的滴定计异， 2 个连续稀释液在两周内转染后的G F P .阳性细胞数比 值必须接近1 : 2 的预期值。当< 1 5 % 的靶细胞转化后，此线性化结果能被观察到。 支 持 方 案 2 滴 定 慢 病 毒 L a c Z 载 体 株 含 L acZ 的 载 体 （ 如 http://www.tronolab.unige.ch—些列表中的）最好是用检 测 P-半乳糖苷酶的免疫化学方法滴定。标准96孔板很好用，因为在40倍放大的显微镜 下，整个孔都清晰可见。细胞2吐内增多1 倍 ，则多数转化情况都是出现2〜4 个 &色 细胞簇。单个蓝色簇很少，但是也有。蓝色细胞簇的数目必须要很少，以助于鉴定^ 个 蓝色细胞簇是单个转化事件的结果。有 10〜1〇〇个蓝色斑点的孔可以计数转化事件。 附加材料（ 基本方案；标_^/的条目参见附录1) H e L a 细 胞 （ A T C C # C C L -2) 载 体 （ 基本方案） (w A 〇 多聚甲酸溶液 VXgal染色溶液 96孔组织培养板 37°C ， 10% CO2 增湿培养箱 多级移液器和tip 倒置显微镜 1. 滴定前一天，在 每 个 9 6 孔板的孔中，用 200jul DMEM-1 0 准 确 接 种 5〇〇〇 数量的 HeLa细胞，并保证细胞平均分布于孔板底部。 37° C ， 10% C〇2 孵育过夜。每个、滴定 都重复操作，做平行对照。 2. 在第二个纵列的孔里，加人用198JU 1DMEM-10稀释好的2/J 载 体 液 （ 共 4〇〇jlJ)，第 一列的孔做空白对照。 3. 用排枪做一系列的梯度稀释，从第二列孔开始取20 0 4 液体打入下一列，然后补足 4〇〇 W，依次稀释下去之至倒数第二列。每次都用枪吹打均匀。 37°C孵 育 2df 〇 4. 检测L a c Z 阳性，去除j ;首养基，用 400jul P B S 洗一'次，用 250^1 4 % 多聚甲酸溶液准
    确固定5min，用 P B S 洗两次，加 入 250^1 Xgal染色液。 37°C 孵育，定期查看。 5 . 用 25CV1PBS替换X gaU 如果必要，在 4°C保存至少一周。 6. 在倒置显微镜下，在含有1〇〜1〇〇个蓝色斑点的2 个孔里计数转化事件。参考稀释 因素区分转化事件，并乘1〇〇倍来求算滴定度（T U /ml)。

    来源：丁香实验

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