细胞因子简介
细胞因子(Cytokine,CK)是一类能在细胞间传递信息、具有免疫调节和效应功能的天然活性蛋白质，可以有效促进免疫细胞(如DC细胞，CIK细胞等)、干细胞的体外生长。根据细胞因子主要的功能可分为以下几类：
1，白细胞介素（Interleukin,IL)由淋巴细胞、单核细胞或其它非单个核细胞产生的细胞因子，在细胞间相互作用、免疫调节、造血以及炎症过程中起重要调节作用。
2，集落刺激因子（Colonystimulatingfactor,CSF)根据不同细胞因子刺激造血干细胞或分化不同阶段的造血细胞在半固体培养基中形成不同的细胞集落，分别命名为G-CSF、M-CSF、GM-CSF、SCF、EPO等。不同CSF不仅可刺激不同发育阶段的造血干细胞和祖细胞增殖的分化，还可促进成熟细胞的功能。
3，干扰素（Interferon, IFN)是某些病毒感染的细胞产生一种物质，可干扰病毒的感染和复制。根据干扰素的来源和结构，可分为IFN-α、IFN-β和IFN-γ，分别由白细胞、成纤维细胞和活化T细胞所产生，具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等作用。
4，肿瘤坏死因子（Tumornecrosisfactor,TNF)根据其产生来源和结构不同，可分为TNF-α和TNF-β两类，前者由单核-巨噬细胞产生，后者由活化T细胞产生，又名淋巴毒素。TNF除具有杀伤肿瘤细胞外，还有免疫调节、参与发热和炎症的发生。
5，转化生长因子-β家族（Transforminggrowthfactor-βfamily,TGF-βfamily)主要包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGFβ1β2以及骨形成蛋白（BMP）等。
6.趋化因子家族（Chemokinefamily)包括两个亚族：
（1）C-X-C/α亚族，主要趋化中性粒细胞，包括IL-8、黑素瘤细胞生长刺激活性(GRO/MGSA）、血小板因子-4（PF-4）、血小板碱性蛋白、蛋白水解来源的产物CTAP-III和β-thromboglobulin、炎症蛋白10（IP-10）、ENA-78；
（2）C-C/β亚族，主要趋化单核细胞，包括巨噬细胞炎症蛋白1α（MIP-1α）、MIP-1β、RANTES、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1/MCAF）、MCP-2、MCP-3和I-309。
7.其它细胞因子，如表皮生长因子（EGF）、血小板衍生的生长因子（PDGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、肝细胞生长因子（HGF）、胰岛素样生长因子-I（IGF-1）、IGF-II、白血病抑制因子（LIF）、神经生长因子（NGF）、抑瘤素M（OSM）、血小板衍生的内皮细胞生长因子（PDECGF）、转化生长因子-α（TGF-α）、血管内皮细胞生长因子（VEGF）等。
重组细胞因子是利用基因工程技术在一定的宿主细胞中表达并经过一系列分离纯化工艺制备而成的细胞因子产品，目前已经广泛用于细胞治疗等相关研究领域和医药领域，如肿瘤、感染和造血障碍等疾病的治疗。
细菌来源细胞因子
上世纪70年代出现的基因工程重组技术，使得使用原核细菌宿主，如大肠杆菌进行天然蛋白的重组表达和生产风靡一时，因其速度快、生产成本低、产率高等优点，广泛用于包括细胞因子在内的多种重组蛋白表达的科研和生物制药领域。
但随之而来，使用低等细菌进行蛋白表达的技术弊端也日益显现：低等原核细菌宿主表达的细胞因子，其结构和天然细胞因子蛋白有较大的差异。
由于缺乏高等动物细胞中特有的各种细胞器，细菌表达的蛋白肽链无法完成翻译后修饰，缺乏必要的糖基化和磷酸化，二硫键配对完全随机；细菌表达细胞因子的稳定性和半衰期和天然细胞因子相比相差较大；细菌无法实现蛋白分泌表达和复杂的酶切后处理，胞内表达易形成无任何空间结构和活性的包涵体颗粒，不得不进行繁冗的体外复性，批间活性差异难以有效控制；细菌细胞壁释放大量的内毒素，后续的蛋白提纯工艺面临巨大挑战。
随着生命科学技术的不断进步，我们越来越清晰的认识到，细胞因子的功能及活性取决于细胞因子是否具有天然的蛋白构象，是否具有正确的蛋白酶加工处理，是否形成了正确配对的二硫键，是否拥有天然的正确的糖基化和磷酸化修饰。
因此，仅仅具有正确的蛋白质一级序列是远远不够的，通过传统复性工艺也不可能解决以上细菌宿主的诸多问题，需要开发新的活性蛋白表达生产技术，全面克服细菌宿主的根本缺陷。
表达宿主的选择
低等细菌表达的细胞因子无法实现正确的空间折叠结构，缺乏必要的糖基化和磷酸化修饰，因此比活和稳定性较差，批间活性差异较大。
低等的真核细胞，如昆虫细胞和CHO鼠细胞，虽然可以进行一定的糖基化和磷酸化修饰，但由于种属和进化程度的显著差异，所形成的糖基化组成和结构不同于天然人细胞因子，影响了其功能和活性。
天然人细胞因子的最佳表达宿主系统自然是人源细胞本身。与其他宿主来源的重组细胞因子相比，使用人源细胞表达生产的重组细胞因子拥有和天然蛋白完全一致的糖基化结构，因此具有100%正确的天然构象，从而体现出卓越的生物活性、最佳功能以及更好的稳定性。
较早的研究表明，部分细胞因子或蛋白的活性似乎不依赖于是否具有糖基化修饰。但是随着近年来研究的不断深入，目前已经确定：蛋白形成正确糖基化对于其保持正确的结构和稳定性具有决定性的作用。细胞因子翻译后的糖基化修饰，一定程度改变蛋白的亲水性质和电荷分布，从而帮助蛋白形成正确的空间折叠结构，不仅可以发挥更好的生物学功能活性，还有利于维持细胞因子的稳定性，延长其半衰期。
图4 不同宿主表达IL-4在细胞培养基中的稳定性比较(37C, 5 days)
例如白介素4，如上图所示：人源细胞表达生产的IL-4由于具有正确完整糖基化修饰，SDS-PAGE的表观分子量为20 kDa左右，而E.Coli来源的IL-4缺乏糖基化，因而分子量仅为14 kDa。由于具有正确的糖基化，因此，将等量两种不同宿主来源的细胞因子加入到细胞培养基中在37度下培养5天后，细菌来源的白介素4活性显著降低，而人源细胞生产的白介素4活性保持不变，具有很好的稳定性，避免多次重复添加。
人源细胞表达技术
相比低等细菌等宿主而言，人源细胞表达技术生产高活性的重组细胞因子具有诸多优势。但是，人源细胞表达生产细胞因子产量低、成本较高。因此，如果突破人源细胞表达技术瓶颈，显著提高表达量，降低生产成本成为关键。
随着新型技术的不断出现，目前多种细胞因子已经采用高等人源细胞成功的表达，实现高活性细胞因子的规模化生产。例如
ACROBiosystems USA 公司率先推出
HEKMax 的新型人源细胞表达蛋白的开发生产平台技术，将人源细胞表达蛋白的效率显著提升。通过将最优化的人源细胞系、新型表达载体、完全化学界定的无血请无蛋白培养基和亲和层析下游提纯工艺相结合，将蛋白的表达量提高2-10倍，因而显著的降低生产成本，使人源细胞表达高活性细胞因子的规模化生产成为可能，显著地推动了行业和技术的发展。
表2 HEKMax人源细胞表达技术显著提高表达量
人源细胞表达高活性细胞因子实例
实例1：细胞因子TNF alpha
TNF alpha 是TNF superfamily超家族中非常重要的成员之一，在炎症反应、细胞凋亡以及免疫系统分化过程中扮演着举足轻重的作用。天然状态下，18 KDa的TNF alpha单体会在胞内组合形成非共价三聚体(54 kDa)的天然活性结构。大肠杆菌来源的TNF-alpha和人源细胞来源的TNF-alpha在还原SDS-PAGE上看不出任何区别，均为18 KD大小的均一条带。但是，当使用HPLC凝胶过滤进行分析时发现：人源细胞表达的TNF alpha为天然三聚体活性结构，分子量大小约为54 KDa，而E.Coli来源的TNF-alpha是单体，分子量为18 KDa左右，和天然三聚体结构有较大差异，其比活和稳定性也相对较差。
图5 不同宿主来源的TNF alpha的结构比较
实例2：细胞因子VEGF165
VEGF早期称作血管通透因子，是血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子(heparin-binding growth factor)，可在体内诱导血管新生(induce angiogenesis in vivo)，能直接作用于血管内皮细胞促进血管内皮细胞增殖，增加血管通透性。VEGF165 是血小板源性生长因子家族的重要成员之一。
常见的VEGF是使用非人源细胞如E.Coli大肠杆菌或低等昆虫细胞(Insect Cell)表达。E.Coli大肠杆菌或昆虫细胞(Insect Cell)来源的VEGF165 蛋白通常是单体和二聚体的混合物，由于没有糖基化或只有部分糖基化，这些来源的VEGF蛋白在还原SDS-PAGE电泳分析时通常是18-34 KDa的不均一条带。而人源细胞表达的VEGF165 蛋白在电泳分析时是一条清晰的完全糖基化的45 KD均一条带，且全部是以活性二聚体形式存在，因此比大肠杆菌或昆虫细胞来源的蛋白具有更好的生物活性（下图所示）。
图6 不同宿主来源VEGF165的活性比较
总结和展望
随着对免疫细胞和干细胞研究的不断深入，对于高活性的细胞因子需求日益增加。人源细胞表达的细胞因子从根本上克服了细菌来源细胞因子的弊端，成为技术发展的趋势。
人源细胞表达的细胞因子具有如下优点：
-正确的糖基化和磷酸化修饰，100%天然空间构象
-细胞分泌表达过程中，自动正确折叠，活性比细菌来源细胞因子高5-10倍
-更好的稳定性和更长的半衰期
-从根本上杜绝了热源的污染
-使用化学界定培养基，无外源动物源性成份污染，安全性更好
因此，高效的人源细胞表达技术可以显著降低的高质量细胞因子的生产成本，促进免疫细胞和干细胞技术的发展、疾病机理和新型疗法的研究，以及新型蛋白药物的开发和生产提供有力的保证，必将最终促进生物医药、生物技术的发展，为人类的健康事业做出突出的贡献！
ACROBiosystems USA公司简介
ACROBiosystems 公司总部位于美国马里兰州Bethesda，首创领先的
HEKMax 人源细胞高效表达技术，基于世界领先的大规模动物细胞培养技术平台，专注于100%天然构象的高质量细胞因子/重组蛋白的开发与生产，全世界范围内提供各种高活性重组蛋白产品及技术服务，同时以高质量、短供货周期与高性价比著称于行业。ACROBiosystems开发的
Active Max细胞因子品牌以100%天然构象、高活性、低内毒素、高稳定性、无动物源性成分等优点，热销全世界30多个国家。ACROBiosystems已与多家国际著名生物制药公司/研究院所形成长期合作伙伴关系，2010年进入中国市场以来，目前也得到国内多家知名制药公司、科研院所和权威检验机构的验证认可，有效的促进国内生物新药的研究和开发。ACROBiosystems中国公司在北京经济技术开发区建立生物技术研发中心，通过执行ACROBiosystems全球用户市场策略，致力于为中国客户提供优质产品与支持服务。
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