重组羧肽酶 B 的性质与抗体碱性峰检测
雅心生物
7073
羧肽酶B (EC 3.4.17.2) 专一用于蛋白质 C-末端碱性氨基酸（赖氨酸、精氨酸、组氨酸）的水解；又称为肽酰-L-赖氨酸（L-精氨酸）水解酶；精蛋白酶。分子量为 35kD，等电点为 6.0，最适 pH 为 7-9。羧肽酶B 是抗体碱性峰检测的特异酶，通过比较酶切前和酶切后的图谱来计算抗体碱性变体的比例，对于抗体的发酵工艺和纯化工艺稳定性的控制都具有重要的意义。
而在抗体碱性峰的检测中，没有完全统一的标准，如酶解缓冲液酶的用量，酶解时的温度和时间等。而这些与酶的性质密切相关。
可以选择的羧肽酶B 有两种，一种是动物胰腺提取的羧肽酶B，一种是基因工程的重组羧肽酶B，前者由于胰腺中含有各种蛋白酶，如胰蛋白酶、糜蛋白酶等，常常不能彻底去除，在酶切时会有非特异的酶切杂峰出现，影响结果判断。后者为基因工程生产的，成分单一，无杂酶，比活高，应用上更有优势。
羧肽酶 B 的结构
天然存在的羧肽酶B 是由前羧肽酶原B（preprocarboxypeptidase B，preproCPB）经酶解产生，后者 N-末端包含 108 个氨基酸（其中 13 个氨基酸为信号肽序列，95 个氨基酸组成前导肽部分）的多肽片段与 CPB 相连。前羧肽酶原B 在转运到内质网的过程中，信号肽被切掉，得到无酶活性的羧肽酶原B（procarboxypeptiedase B, proCPB）并从细胞中分泌出来，最终在小肠中经胰蛋白酶在 Arg-95 处酶解，成为具蛋白酶活性的 CPB。
proCPB 的分子量为 46kD，由 401 个氨基酸组成；CPB 分子量为 35kD，由 306 个氨基酸组成。在CPB 中，前体的活化主要依赖胰蛋白酶在 Arg95 位的切割，半球形前导肽被切割后，它既不会抑制酶体，也不再与之结合，这使得酶体能迅速发挥功能，并对前导肽 C-端的 Arg 进行切割。
（上面暗红色部分代表前肽，下面蓝色部分代表羧肽酶B，箭头所指为胰蛋白酶酶切激活位点）羧肽酶 B 的性质取重组羧肽酶 B 冻干粉。研究了重组羧肽酶 B 的最适 pH，最适温度，pH 稳定性及温度稳定性，对于 CPB 的使用起到指导作用。同时做了溶液的反复冻融稳定性，对于 CPB 酶液的储存和使用起到指导作用。
1、羧肽酶B 的 pH 稳定性
将纯的重组羧肽酶 B 用纯水溶解为 10 mg/ml，之后用以下缓冲液稀释使酶液的终浓度为 1 mg/mL，pH 分别为 3.0、4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、10.0、11.0、12.0， 25℃ 孵育 12 h 后测活。
2、羧肽酶 B 的最适 pH
测定 rCPB 纯酶液浓度为 1 mg/mL, 在不同 pH 条件下的催化速率，底物浓度为 0.1 mM/L，pH 分别为 3.0、4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、7.65、8.0、8.5、9.0、10.0、11.0、12.0，pH3.0-5.0 用 50 mMNaAc-HAc 缓冲液配制，pH6.0-7.0 用 50 mMKPB 磷酸盐缓冲液配制，pH7.5-8.5 用 50 mM Tris-HCl 缓冲液配制，pH9.0-12.0用 50 mM Gly-NaOH 缓冲液配制。
3、羧肽酶B 的温度稳定性
将 rCPB 酶液配成浓度为 1 mg/mL，置于 4℃、25℃、30℃、40℃、50℃、60℃ 条件下，每个温度三个平行，时间定为 15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、8 h、20 h 分别取样测定其活性，以初始时酶活定为 100%，以残余酶活百分比表示测定结果。
4、羧肽酶B 的最适催化温度
在不同温度下恒温水浴测活底物，使底物的温度分别为 4℃、25℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃，取适量 rCPB 纯酶液，测定活力。以 254nm 吸光值 OD254 为纵坐标，时间为横坐标。
5、羧肽酶B 酶液的反复冻融稳定性
将 rCPB 酶液反复冻融，测定每次冻融后的酶活，计算活力保留率，得到同一管 rCPB 反复冻融 10 次后的活力稳定性。
结果表明重组羧肽酶B 反复冻融稳定性好。经过 10 次的反复冻融，几无活性损失。
6.抗体碱性峰检测
羧肽酶B 的准备：用 1X PBS pH7.5, 溶解羧肽酶B 至 1 g/L，分装后-20℃ 保存。
抗体：纯化后的单抗样品超滤至磷酸缓冲液（pH=7.5）中（1~2 g/L）。
酶用量：按样品：酶= 20:1-100:1，此处用量为 100:1。
孵育温度及时间：37℃ 反应 30 分钟。检测：直接进样 HPLC 检测
雅心生物多年来致力于重组蛋白酶的研究，可提供生物医药用酶及相应的申报用资料。测序级肽图用酶如重组胰蛋白酶、重组羧肽酶 B、V8 和重组糜蛋白酶等。
