mRNA差别显示技术实验流程

mRNA差别显示技术也称为差示反转录PCR（Differential Display of reverse Transcriptional PCR）简称为ddRT-PCR。它是将mRNA反转录技术与PCR技术二者相互结合发展起来的一种RNA指纹图谱技术。目前已广泛应用于分离鉴定组织特异性表达的基因。

差别基因表达（differential gene express）是细胞分化的基础。mRNA差别显示技术正是对组织特异性表达的基因进行分离的一种快速而行之有效的方法。该方法的基本原理是首先选取不同的组织样品或不同发育阶段的同一组织样品或同一组织样品经不同药物处理诱导的样品，经总RNA提取后，进行mRNA反转录合成cDNA。

此cDNA的合成是采用Oligo（dT）12 MN为引物，其中M为A，C，G中的任意一种，N为A，C，G或T中的任意一种，所以共有12种oligo（dT）12 MN引物，其中M称为锚定碱基，起增大引物Tm值的作用，N称为分类碱基，对反转录进行分类。

用这12种引物分别对同一总RNA样品进行cDNA合成，即进行12次不同的反转录反应，从而使反转录的cDNA具有12种类型，也就是对cDNA进行12种归类（目前较为流行的方法是进行4种归类，即M为简并碱基的形式存在），在此基础上对每一类cDNA进行随机引物和反转录引物PCR扩增，通过对组织样品的同一类cDNA的PCR选择性扩增产物凝胶电泳分析，从而反映出不同样品间基因的时间和空间上组织特异性的表达。

如此众多种类的mRNA反转录产物经PCR选择扩增后其类型依然为数众多，很难用电泳系统加以快速准确地分离。因而需要对反转录产物cDNA进行归类处理，减轻不同PCR产物电泳分离的难度，提高分离的准确率。（见示意图）

一、实验流程：

这里以CLONTECH公司生产的DeltaTM Differential Display Kit为例，介绍具体的实验步骤。该试剂盒中含有10种任意引物和9种Oligo(dT)引物。

操作步骤

1. 总RNA的提取（见Northern 杂交）

2. 第一链合成：

① 总RNA样品 2μg；cDNA合成引物 1μl；加ddH2O补至5μl。将管标号为1A,2A,PC A等。PC为阳性对照。

② 混匀后稍离心。

③ 70℃孵育3min，冰浴2min后稍离心。

④ 准备dNTP mix (以5管为例 )

⑤ 每管加入5μl，混匀后稍离心；42℃孵育1hr。

⑥ 75℃ 10min终止反应后置冰上，稍离心。

⑦ 将2μl反应液分别转至新管中（新管标号为1B,2B,PC B等）。

⑧ 将78μl ddH2O分别加入B管中,混匀。

⑨ 将72μl ddH2 O分别加入A管中，混匀。

⑩ 将所有cDNA稀释液 -20℃保存待用。

3．dd-PCR: 以 引物P1,T9为例说明

（0.5ml PCR管，1代表对照组，2代表实验组）