【资源】实验十一 SDS-PAGE检测表达蛋白

1．目的

学习SDS-PAGE的基本操作，学会用SDS-PAGE检测蛋白。

2．原理

蛋白质在加热变性以后与SDS结合，带上负电荷，在电场的作用下，向正极移动，结果按分子量大小排列在胶板上，含量多的蛋白带纹粗。

3．器材

旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，台式冷冻离心机，制冰机，超声波破碎仪，电磁炉，电泳仪，垂直电泳槽及配套的玻璃和密封条、梳子等。

4．试剂

SDS（十二烷基磺酸钠），Acr（丙烯酰胺），Bis（N,N’-亚甲基双丙烯酰胺），Tris（三羟甲基氨基甲烷），甘氨酸，盐酸，Aps（过硫酸氨），TEMED（四甲基乙二胺），蛋白分子量标准（97.4，66.4，44.3，29.0，20.1，14.3 kDa），溴酚蓝，甘油，冰醋酸，乙醇，b-2-巯基乙醇，考马斯亮蓝R250，甲醇，乙醇。

5．实验准备

1.0mol/L Tris HCl，pH8.8（4°C保存）；0.5mol/L Tris-HCl，pH6.8（4°C保存）；10%SDS（室温保存）；30%Acr/Bis（30g Acr+0.8g Bis dd water 定容至100ml，4°C保存）；10%Aps （-20°C保存）；2´上样缓冲液（0.5mol/L Tris HCl，pH6.8 2ml，甘油2ml，20%SDS 2ml， 0.1%溴酚蓝 0.5ml，b-2-巯基乙醇 1.0ml，ddH2O 2.5ml，室温存放）；5´电泳缓冲液（Tris 7.5g ，甘氨酸36g，SDS 2.5g，加ddH2O至500ml，使用时稀释五倍）；考马斯亮蓝染色液（考马斯亮蓝R250 0.25g + 45ml甲醇+10ml冰醋酸，用ddH2O定容至100ml）；脱色液（95%乙醇：冰醋酸：水= 4.5：0.5：5，体积比）；

6．操作步骤

（1）将表达后的菌体与2´上样缓冲液按1：1混匀于微量离心管中。

（2）用超声波破碎仪脉冲10次，每次10秒。中间间隔时放入冰中降温。注意一定要将超声波探头插入溶液底部，在溶液表面或上部时容易起泡！

（3）将上述微量离心管插入水漂中，放在电磁炉锅里的沸水中煮3~5min。然后立即插入冰中。（可在-20°C冰柜中保存）。

（4）按照教师的演示组装电泳玻璃并用细橡胶管密封底部和侧面然后用夹子夹住（不能夹玻璃的上端以免夹断玻璃的突出段！）。插入梳子后在玻璃上距离梳子齿底部1cm的地方做一个标记。

（5）配制10%分离胶。按顺序和量（注意体积单位！）取下列溶液混在一个50ml的小烧杯中（注意Tris为 pH8.8）：

Acrylamide-bis 3.96 ml
1M Tris PH8.8 4.38 ml
ddH2O 3.432 ml
10% SDS 118.8 μl
TEMED 9.9 μl
10%APS 118.8μl

（6)加完APS后拿起烧杯轻轻转动几下底部将溶液混匀后，立刻缓缓倒入玻璃夹缝中，直到液面与所作的标记齐平。剩下的胶液留在小烧杯中，倾斜放置。然后在上部用1000ml微量移液器轻轻地沿玻璃壁来回移动加满ddH2O（尽可能不破坏下面的胶液）。然后静置30min。

直到烧杯中剩余的溶液凝固。倒出蒸馏水，并倒置玻璃尽可能将水倒尽。

（7)配支持胶。按顺序和量（注意体积单位！）取下列溶液混在一个50ml的小烧杯中（注意Tris为 pH6.8）：

Acrylamide-bis 0.675 ml
0.5M Tris pH6.8 0.563 ml
ddH2O 3.165 ml
10% SDS 45 μl
TEMED 7.5 μl
10% APS 45μl

（8） 加完APS后拿起烧杯轻轻转动几下底部将溶液混匀后，立刻倒入玻璃夹缝中，液面与玻璃上边缘齐平。然后再慢慢插入梳子，静置约20min。烧杯中剩下的溶液倾斜放置直到溶液凝固。（此状态可以用塑料薄膜包起来放入冰箱过夜）。

（9） 小心拔出梳子以后，用注射器针头（剪平尖部）吸取梳子齿形成的加样槽中的水，并修平加样槽底部的胶面。

（10）选取几个形态好的加样槽，在一张纸上做好对应的标记，用微量移液器在侧面的一个加样槽中加入20μl 蛋白分子量标准Marker，其它槽中加入10～20μl自己制作的样品。

（11）加完样品后，再用微量移液器吸取电泳缓冲液小心把加样槽液面都补平。电泳槽上部倒满电泳缓冲液（约250ml,淹没过加样槽的液面！），电泳槽的下部倒入一半电泳缓冲液（约180ml）。

（12）接好电极，将电流调至10mA，待溴酚蓝移到分离胶后，在将电流调至18mA，电泳约2~3h，期间随时观察电泳槽上部的液体是否有泄漏（泄漏导致液面下降，电流中断）！当溴酚蓝移到玻璃距底部0.5cm时切断电源。

（13）在一个搪瓷盘里准备适量的考马斯亮蓝染色液。

（14）倒掉电泳槽中的缓冲液，取下玻璃，小心用铲子从下部将带有缺口的玻璃板撬起（切不可损坏胶！）。用铲子切去上部的支持胶，并把分离胶从玻璃上剥离倒染液搪瓷盘里（切不可损坏胶！）。

（15）染色2h后，将染液倒回瓶子里以备重复使用。把胶移入脱色液，过夜。

（16）观察脱色后胶里的蓝色带纹，与对照比较或寻找异常粗的带纹，并比较其分子量（CHI蛋白约30kDa），判断是否是预期的基因产物。

（17）清理桌面，写实验报告。

7．思考

（1）影响表达的因素都有哪些？

（2）如何确定凝胶上的某条蛋白质带就是所要表达的外源基因产物？

（3）表达产物的形式是包涵体还是可溶性蛋白？

（4）本实验能否判断表达产物一定是CHI蛋白？还需要什么方法?

（5）如何估计表达产物的分子量？