重组蛋白在E.coli中表达及纯化

一. 实验目的

1. 掌握重组蛋白诱导表达的方法。

2. 亲和层析法纯化His 标记的融合蛋白。

二. 实验原理

将目的基因连接在表达载体后，通过加入诱导剂IPTG诱导目的基因表达。表达载体除具有蛋白表达所需要的启动子外，在终止子前有6个His编码序列，便于蛋白的亲和层析纯化。

亲和层析以蛋白质或生物大分子和结合在介质上的配基间的特异亲和力为基础。本实验采用磁座和结合有Ni2+的磁珠在变性或非变性条件下对融合蛋白进行分离纯化，只需通过“结合-清洗-洗脱”三个简单的操作步骤就可完成。该系统可根据样本量灵活调整磁珠用量，从而进行小量和大量蛋白纯化，并且磁珠可以再生使用。

大体过程：

　　载体表面先键合一段间隔臂，再连接上配基
　　　　　　　　　　↓
　　固体化的配基只能与和它有特异亲和性的蛋白质分子互相作用而吸附
　　　　　　　　　　↓
　　改变流动相条件将吸附的蛋白质洗脱下来

三. 试剂及器材

1.磁珠（浓度为25%，v/v），储存于100mM NiSO4溶液中，2～8℃。注：磁珠不能干燥，不能离心，不能冰冻。

2.PBS缓冲液：137mM NaCI，2.7mM KCI，4.3mM Na2HPO4，pH7.5。

3.结合液/缓冲液：0.5M NaCI，20mM Na2HPO4，10mM imidazole，pH7.4。

4.洗脱液：0.5M NaCI，20mM Na2HPO4，0.5M imidazole，pH7.4。

四. 实验操作

(一)蛋白的诱导表达

1. 挑取含重组质粒的单菌落，接种于含相应抗生素的培养基中（Amp），37℃振荡培养过夜。

2. 次日以5%量接种，37 ℃培养至OD=0.6时，加入IPTG（终浓度为0.1mM）37℃诱导表达2～3h。

3. 收集细菌（每人3ml，分两次收集），5000rpm离心3min。

PBS缓冲液清洗一次后同样条件离心后再次收集菌体。每3ml菌液的菌体加入0.4ml结合液悬浮。

(二)细菌的破碎

1. 加入溶菌酶4μl（100mg/ml），使得终浓度为1mg/ml，放置冰浴中30～60min充分酶解。

2. 5000rpm离心5min，收集上清液4℃贮存备用，或接下一步层析纯化。

(三)融合蛋白的亲和层析

1. 将瓶内磁珠轻轻摇匀，取出200 μl（含50 μl净磁珠）到离心管中，将离心管插入磁座，磁力吸附约1分钟，弃除所有上清液。
　　2. 将离心管从磁座上取下，加入1 ml结合液，盖好盖子，摇匀磁珠后，插入磁座，磁力吸附约2分钟，弃除所有上清液。
　　3. 重复步骤2两次。
　　4. 将离心管从磁座上取下，加入预处理好的样本，盖好盖子，摇匀磁珠后，室温下轻轻摇动10分钟。
　　5. 将离心管插入磁座，磁力吸附约3分钟，弃除所有上清液。
　　6. 取下离心管，加入1 ml清洗液，盖好盖子，摇匀磁珠后，轻轻摇动1分钟后插入磁座，磁力吸附约3分钟，弃除所有上清液。
　　7. 重复步骤6两次。
　　8. 取下离心管，加入150μl洗脱液，轻轻摇动5分钟，插入磁座，磁力吸附约3分钟，将上清液转入到新的离心管中。
　　9.为了增加融合蛋白产量，重复步骤8洗脱1～2次。
　　10.洗脱蛋白后的磁珠按再生方法处理。
　　(1). 用5倍净磁珠体积的0.1M EDTA pH8.0，含0.5M NaCl重悬磁珠，室温摇动1分钟后，插入磁座至溶液澄清，弃上清。
　　(2). 用5倍净磁珠体积的2M NaCl重悬磁珠，室温摇动1分钟后，插入磁座至溶液澄清，弃上清。
　　(3). 用5倍净磁珠体积的1M NaOH重悬磁珠，室温摇动5分钟后，插入磁座至溶液澄清，弃上清。
　　(4). 重复步骤3两次。
　　(5). 用5倍净磁珠体积的70%乙醇重悬磁珠，室温摇动1分钟后，插入磁座至溶液澄清，弃上清。
　　(6). 用5倍净磁珠体积的超滤水重悬磁珠，插入磁座至溶液澄清，弃上清。
　　(7). 重复步骤6一次。
　　(8). 用4倍净磁珠体积的100mM NiSO₄重悬磁珠，室温摇动5分钟。若接着要进行蛋白的分离纯化，将离心管插入磁座弃上清，用5倍净磁珠体积的结合液平衡三次后即可使用；若不进行蛋白的分离纯化，将装有磁珠和溶液的离心管竖直储存于2～8℃。