过氧化物酶活性的测定(比色法)
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过氧化物酶活性的测定(比色法)
原理
过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中。在有过氧化氢存在下,过氧化物酶能使愈创木酚氧化,生成茶褐色物质,可用分光光度计测量生成物的含量。
仪器药品
721型分光光度计 离心机
秒表 天平
研钵 磁力搅拌器
愈创木酚 30%过氧化氢
20mmol/L KH2 PO4
100mmol/L 磷酸缓冲液, pH6.0(见附表2)
反应混合液:100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)50ml于烧杯中,加入愈创木酚28μl,于磁力搅拌器上加热搅拌,直至愈创木酚溶解,待溶液冷却后,加入30%过氧化氢19μl,混合均匀,保存于冰箱中。
操作步骤
1.称取植物材料1g,加20mmol/L KH2 PO4 5ml,于研钵中研磨成匀浆,以4000r/min离心15分钟,倾出上清液保存在冷处,残渣再用5mlKH2 PO4 溶液提取一次,合并两次上清液,贮于冷处备用。
2.取光径1cm比色杯2只,于1只中加入反应混合液3ml,KH2 PO4 1ml,作为校零对照,另1只中加入反应混合液3ml,上述酶液1ml(如酶活性过高可稀释之),立即开启秒表记录时间,于分光光度计上测量吸光度值,每隔1分钟读数一次,读数于波长470nm下进行。
3.以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小,即以△ A 470/min·mg蛋白质(或鲜重g)表示之。蛋白质含量测定参阅实验56。