平末端连接构建载体的一些个人经验

这是在网上看到的，觉得还行，大家看一下

1、载体和插入片段DNA的量都要比黏末端连接时的用量多，可以增加到5倍以上。

2、载体务必去磷酸化处理(许多公司都有这类酶，比如NEB的CIP(点击进入产品页面)。

3、如果是PCR生成插入片段，要用产生平端片段的PCR酶(如PFU)，必须磷酸化5'末端，可以磷酸化引物，也可以磷酸化产物，我一般磷酸化产物，这一步最关键也最容易遗漏(请参考T4PNK(点击进入产品介绍)。普通Taq酶PCR以后可以补平再做连接，但是仍然需要磷酸化，当然如果是PCR以后再酶切成平端那和普通酶切片段是一样的。

4、按照分子克隆第三版介绍，如果线性化载体时所用的内切酶在插入片段序列内没有位点，酶切和连接可以在一个反应体系内同时完成(相关内容请查阅分子克隆III)，但是我的实验证明这个方法效率并不高。

我建议采用下面方法：酶切载体->分离片段->CIP->插入片段磷酸化->纯化片段->按照正常连接反应，体系内加入线性化载体所用内切酶，按照酶切1/10浓度加入。这样基本上可以完全阻断载体自连接(因为凡是载体自连都将被酶切再次线性化，而插入片段形成新质粒则不会被酶切)，提连接效率。

5、连接酶用量也要适当增加，建议用高浓度连接酶T4 DNA ligase(点击连接产品页面)，不要用快速连接方法。

6、连接体系是否加入PEG，好象没有显著差别，另外PEG分子量也没有特殊要求，PEG4000到PEG8000都曾经出现在公司药合里面。
--------------------------------------------------------------------------
PCR 引物或者产物的磷酸化反应：

Primer (oligo 5-10 pmol/ul, use 2-4 ul in PCR mix)
or PCR product--------------------------------------40ul
T4 PNK Buffer-----------------------------------------6ul
T4 PNK--------------------------------------------------3ul (30U)
0.1M ATP--------------------------------------------0.6ul
H2O--------------------------------------------------10.4ul

Total Volume 60ul