核酸分析技术

PCR技术

（一）PCR (Polymerase chain reaction) 是用一对寡聚DNA作为引物，通过加温变性－退火－DNA合成这一周期的多次循环，使目的DNA片段得到扩增。由于这种扩增产物是以指数形式积累的，经25－30个循环后，扩增倍数可达106。
Dr. Karry Mullis 1985年发明，获1993年度诺贝尔化学奖；

（二）基本要素

1、Taq DNA聚合酶：

水生栖热菌(thermus aquaticus,Taq)的DNA聚合酶

①5’→3’DNA聚合酶活性；

②无3’→5’外切酶活性，

35轮0.25%错配，与原始模板有差别；

最适聚合酶 温度72℃，选择72℃延伸

半衰期：92.5℃ 130min

95℃ 40min

97.5℃ 5―6min

变性温度：≤95℃使其在整个扩增循环中保持足够活性

pfu DNA 聚合酶 耐热

5’→3’DNA聚合酶活性

3’→5’外切酶活性

精确度：pfu %26gt;Taq

但pfu扩增效率通常比Taq酶略差

文献报道：Taq+pfu 会起到较好效果

2、引物

人工合成短寡核苷酸20bp-25bp→Tm=55℃-60℃，

Tm值要相近，每条10-50pmol /100%26#61549;l

◆设计原则：

（1）靠近5'上游Primer与双链DNA正链相同

3'下游Primer与双链DNA正链互补，与负链相同

正链5'――――― 3' ――上游Primer

――下游Primer 负链 3'――――― 5'

例如：

IL-3正链

5'GCTCCATGACCCAG----------- GCGATCTTTTGAGTCCAA 3'

负链3'CGCTAGAAAACTCAGGTT 5'

上游~： 与其相同

下游~： 先写出相应负链3'→5'然后倒过来5'→3'

所以负链Primer：5'-TTg gAC TCA AAA gAT CgC -3'

（2）Primer 本身不要出现内部互补序列

形成loop环，内部二级结构

如： GGGTCGATTCCTACCCATGC

（3）注意减少Primer间互补序列

导致2个Primer形成dimer

一般不要超过3个互补bp

如：CCCATGC ATGGAGTC

: : : : : : : :

GGGTCTA TCAGTAAGC

（4）Primer 5’未端可修饰、突变:

修饰

如：32P、生物素、荧光素，不影响其效果

突变：AGCTCCATGACCCAG

5'CGCTCCATGACCCAG 3‘

注意：绝不可以在3'端进行上述改造

∵DNA聚合酶是5'→3'聚合，若3'端改造→不能互补→不能延伸

（5）primer 5’端增加碱基

①内切酶识别点：

（G）GAATTC GCTCCATGACCCAG

↑保护bp

对PCR产物cloning有很大好处

便于内切酶消化，不同内切酶需保护bP数量不同

EcoRI 1 BglII 2-3

XbaI 2-3 HindⅢ %26gt;3

BamHI 2-3 PstI %26gt;4

XhoI %26gt;4 NotI %26gt;10

如果所用保护bp数量不合适→影响内切酶消化→影响下步克隆

∵未切开，连接不上

②ATG起始密码

③TAA、TAG、TGA终止密码

如：

可溶性受体的表达，无膜内区、穿膜区，只有膜外区。

3、模板：

可选：DNA

mRNA→逆转录→cDNA

DNA包括： 质粒 噬菌体 染色体DNA

较小 较大 ①目的gene是单拷贝

变性较易 变性较难

②非常大，变性难

模板用量

Plasmid:lng

Chromosome:300-500ng

注意：

防止交叉污染

4、dNTP：

四种脱氧核苷酸，基本原料

终浓度：50%26#61549;M

注意：不稳定，保存时间长会失效

5、Mg2+

TaqDNA聚合酶作用时需要Mg2+

不同的酶需不同Mg2+

Taq：较少，Mg2+ 对反应影响很大，0.5-1.5mM终浓度

pfu：Mg2+ 2-3mM，dNTP、primer用量约增加一倍

外界影响：

EDTA鳌合Mg2+ ∴选较低浓度TE(10mM Tris,1mMEDTA)；

DNA模板、引物和dNTP 的磷酸基团均可与Mg2+ 结合， 降低Mg2+有效浓度。 ∴如果扩增产物或效率不理想，要注意调整合适的Mg2+浓度

6、温度和时间：

（1）变性温度：94-95℃

Templete：GC比例高、长度很长，则变性T↑

（2）退火：温度越高，扩增特异性越好

取决于Tm值：Tm↑退火T↑；

Tm↓退火T↓

若Tm较高，可使退火和延伸在同一温度

（3）延伸：

%26#61603;500nt---1min %26#61502;500nt－－3min

一般：40－60sec

（三）PCR技术的应用

1、 基因检测：

2、基因克隆化

3、DNA突变

4、DNA序列分析

四、基因芯片

（一）利用核酸杂交的原理，应用于DNA、RNA的研究

基因芯片（Ｇｅｎｅ Ｃｈｉｐ）就是利用点样机等机械装置，在玻璃等支持物表面整齐地点上高密度的、成千上万个“点”，每个“点”含有可与一种基因杂交的一条ＤＮＡ探针。由于芯片上有序地排列着ＤＮＡ探针，因此也被称为微阵列（Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）。

在芯片上滴加样品后，在合适的条件下，样品中含有的各种核酸片段（ｃＤＮＡ或ｃＲＮＡ）就与相应的探针杂交。由于核酸片段上已标记有荧光素，激发后产生的荧光强度就与样品中所含有的相应核酸片段的量成正比，也就代表该基因的表达量。经激光共聚焦扫描仪等装置扫描后，所获得的信息经专用软件分析处理，即可获得成千上万种基因的表达情况。正因为这种特点，基因芯片技术已成为当前生命科学研究的热点之一。

操作流程

（1）探针的设计、合成与芯片的制作（商品化产品）；

（2）靶基因样品的制备；

靶基因的制备：RT-PCR （设实验组和对照组）
标记方法：分别进行荧光素标记如：Cy3和Cy5

（3）生化杂交反应；与常规的分子杂交过程基本相似

封闭 预杂交 杂交 洗脱

（4）杂交信号的检测与结果的分析

激光共聚焦荧光检测系统收集荧光信号，计算机分析

（二）基因芯片的应用

用于基因转录水平的检测、基因组分析和后基因组研究

举例：美国斯坦福大学Davis等用PCR法从外周血淋巴细胞cDNA文库中得到了1046种cDNA片段，制成芯片，然后与热处理的T淋巴细胞和未处理的T细胞种提取的mRNA反转录出的单链cDNA片段杂交，经激光共聚焦扫描系统分析，共发现17个差异表达的基因，其中11个是被热诱导的，6个是被热抑制的。经序列分析证实，其中3个是未报导的新基因。

三 PCR技术

（一）PCR (Polymerase chain reaction) 是用一对寡聚DNA作为引物，通过加温变性－退火－DNA合成这一周期的多次循环，使目的DNA片段得到扩增。由于这种扩增产物是以指数形式积累的，经25－30个循环后，扩增倍数可达106。
Dr. Karry Mullis 1985年发明，获1993年度诺贝尔化学奖；

（二）基本要素

1、Taq DNA聚合酶：

水生栖热菌(thermus aquaticus,Taq)的DNA聚合酶
①5’→3’DNA聚合酶活性；
②无3’→5’外切酶活性，

35轮0.25%错配，与原始模板有差别；

最适聚合酶 温度72℃，选择72℃延伸
半衰期：92.5℃ 130min
95℃ 40min
97.5℃ 5―6min
变性温度：≤95℃使其在整个扩增循环中保持足够活性

pfu DNA 聚合酶 耐热
5’→3’DNA聚合酶活性
3’→5’外切酶活性
精确度：pfu %26gt;Taq
但pfu扩增效率通常比Taq酶略差

文献报道：Taq+pfu 会起到较好效果

2、引物

人工合成短寡核苷酸20bp-25bp→Tm=55℃-60℃，
Tm值要相近，每条10-50pmol /100%26#61549;l
◆设计原则：

（1）靠近5'上游Primer与双链DNA正链相同
3'下游Primer与双链DNA正链互补，与负链相同
正链5'――――― 3' ――上游Primer
――下游Primer 负链 3'――――― 5'
例如：
IL-3正链
5'GCTCCATGACCCAG----------- GCGATCTTTTGAGTCCAA 3'
负链3'CGCTAGAAAACTCAGGTT 5'
上游~： 与其相同
下游~： 先写出相应负链3'→5'然后倒过来5'→3'
所以负链Primer：5'-TTg gAC TCA AAA gAT CgC -3'

（2）Primer 本身不要出现内部互补序列
形成loop环，内部二级结构
如： GGGTCGATTCCTACCCATGC

（3）注意减少Primer间互补序列
导致2个Primer形成dimer
一般不要超过3个互补bp
如：CCCATGC ATGGAGTC
: : : : : : : :
GGGTCTA TCAGTAAGC

（4）Primer 5’未端可修饰、突变:
修饰
如：32P、生物素、荧光素，不影响其效果
突变：AGCTCCATGACCCAG
5'CGCTCCATGACCCAG 3‘
注意：绝不可以在3'端进行上述改造
∵DNA聚合酶是5'→3'聚合，若3'端改造→不能互补→不能延伸

（5）primer 5’端增加碱基
①内切酶识别点：
（G）GAATTC GCTCCATGACCCAG
↑保护bp
对PCR产物cloning有很大好处
便于内切酶消化，不同内切酶需保护bP数量不同
EcoRI 1 BglII 2-3
XbaI 2-3 HindⅢ %26gt;3
BamHI 2-3 PstI %26gt;4
XhoI %26gt;4 NotI %26gt;10
如果所用保护bp数量不合适→影响内切酶消化→影响下步克隆
∵未切开，连接不上
②ATG起始密码
③TAA、TAG、TGA终止密码
如：
可溶性受体的表达，无膜内区、穿膜区，只有膜外区。

3、模板：

可选：DNA
mRNA→逆转录→cDNA
DNA包括： 质粒 噬菌体 染色体DNA
较小 较大 ①目的gene是单拷贝
变性较易 变性较难 ②非常大，变性难
模板用量
Plasmid:lng
Chromosome:300-500ng
注意：
防止交叉污染

4、dNTP：

四种脱氧核苷酸，基本原料
终浓度：50%26#61549;M
注意：不稳定，保存时间长会失效

5、Mg2+

TaqDNA聚合酶作用时需要Mg2+
不同的酶需不同Mg2+
Taq：较少，Mg2+ 对反应影响很大，0.5-1.5mM终浓度
pfu：Mg2+ 2-3mM，dNTP、primer用量约增加一倍
外界影响：
EDTA鳌合Mg2+ ∴选较低浓度TE(10mM Tris,1mMEDTA)；
DNA模板、引物和dNTP 的磷酸基团均可与Mg2+ 结合， 降低Mg2+有效浓度。 ∴如果扩增产物或效率不理想，要注意调整合适的Mg2+浓度

6、温度和时间：

（1）变性温度：94-95℃
Templete：GC比例高、长度很长，则变性T↑

（2）退火：温度越高，扩增特异性越好
取决于Tm值：Tm↑退火T↑；
Tm↓退火T↓
若Tm较高，可使退火和延伸在同一温度

（3）延伸：
%26#61603;500nt---1min %26#61502;500nt－－3min
一般：40－60sec

（三）PCR技术的应用

1、 基因检测：

2、基因克隆化

3、DNA突变

4、DNA序列分析

四、基因芯片

（一）利用核酸杂交的原理，应用于DNA、RNA的研究
基因芯片（Ｇｅｎｅ Ｃｈｉｐ）就是利用点样机等机械装置，在玻璃等支持物表面整齐地点上高密度的、成千上万个“点”，每个“点”含有可与一种基因杂交的一条ＤＮＡ探针。由于芯片上有序地排列着ＤＮＡ探针，因此也被称为微阵列（Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）。在芯片上滴加样品后，在合适的条件下，样品中含有的各种核酸片段（ｃＤＮＡ或ｃＲＮＡ）就与相应的探针杂交。由于核酸片段上已标记有荧光素，激发后产生的荧光强度就与样品中所含有的相应核酸片段的量成正比，也就代表该基因的表达量。经激光共聚焦扫描仪等装置扫描后，所获得的信息经专用软件分析处理，即可获得成千上万种基因的表达情况。正因为这种特点，基因芯片技术已成为当前生命科学研究的热点之一。

操作流程

（1）探针的设计、合成与芯片的制作（商品化产品）；

（2）靶基因样品的制备；
靶基因的制备：RT-PCR （设实验组和对照组）
标记方法：分别进行荧光素标记如：Cy3和Cy5

（3）生化杂交反应；与常规的分子杂交过程基本相似
封闭 预杂交 杂交 洗脱

（4）杂交信号的检测与结果的分析
激光共聚焦荧光检测系统收集荧光信号，计算机分析

（二）基因芯片的应用

用于基因转录水平的检测、基因组分析和后基因组研究

举例：美国斯坦福大学Davis等用PCR法从外周血淋巴细胞cDNA文库中得到了1046种cDNA片段，制成芯片，然后与热处理的T淋巴细胞和未处理的T细胞种提取的mRNA反转录出的单链cDNA片段杂交，经激光共聚焦扫描系统分析，共发现17个差异表达的基因，其中11个是被热诱导的，6个是被热抑制的。经序列分析证实，其中3个是未报导的新基因。