钙转12小时后细胞死亡

羽缎：我用磷酸钙转染293T细胞，以前做得都好好的，但最近有好几次都转染后八到九小时换液，发现细胞不但不增殖，反而死了2/3，排除细胞污染的原因，HBS也换了，都找不到原因。

丁香园网友wfayew认为：

转然后8-9h？我们都是16小时

那么短的时间细胞还没有适应转染环境吧可能影响转染效率

肉眼观察你的沉淀是否均匀？如果混合时不小心的话形成大块沉淀对细胞刺激还是很大的

做没有质粒的对照组看是否转染试剂的原因

293T养一段时间以后，细胞会老化生长状态和转染效率都会有变化可以重新复苏细胞

丁香园网友羽缎认为：

我说的8-9小时，指的是加入钙后8-9小时后换液，听师兄说，这样是为了避免钙对细胞的刺激，将media换成新鲜的media。

我这批细胞是复苏的一批新细胞，有没有可能冻融细胞将其的转染效率降低了？有什么需要在冻存细胞时注意的么？

还有HBS的PH值，是否是造成细胞死亡的原因呢？

我的这批293T细胞内部有很多黑点，也不动，看上去似乎是代谢物，但是我不是太确定，实验室其他人的细胞也都有这样的情况，但是他们的细胞在转染后并没有死亡。只有我出现这种情况。

实在想不通了，还请大家帮忙一下啊。