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    检测凋亡和其他形式的细胞死亡

    相关实验：检测凋亡和其他形式的细胞死亡

    最新修订时间：

    材料与仪器

    步骤

    基本方案1 用活细胞或荧光染料定量细胞活性

    显微镜观察是一种简单且准确的检测凋亡的方法。凋亡的标志性特征包括细胞核浓
    缩 、细胞膜完整但出现发泡现象，以及清晰的胞质。

    材 料 （带7 项 目 见 附 录 1)

    V 染料混合剂

    P B S 的 细 胞 悬 液 （附 录 1)

    9 6 孔圆底板

    显微镜用的载玻片

    1 号厚度的盖玻片或预先包被了聚左旋赖氨酸的盖玻片（用于非贴壁细胞， Sigma)

    装 有 4 0 倍 或 6 3 倍的物镜和适当滤光片的荧光显微镜（表 2. 14. 1)
    注 ：吖啶橙和溴化乙锭具有高度诱导突变的能力，使用时需特别注意。 1 . 加 5jul染 液 至 9 6 孔圆底板的孔底。 2 . 加 5〇 W 5 X I O 5〜 5 X I O 6 个细胞/ m l 的 P B S 悬液到染液中，轻轻地混匀。淋巴细胞必 须用细胞刮从培养瓶底部刮下。 3 . 取 IOiUl的该混合液放在干净的载玻片上，然 后 盖 上 1 号厚度的盖玻片，对于非贴壁 细胞盖上预先包被了聚左旋赖氨酸的盖玻片。 4 . 用 装 有 4 0 倍 或 6 3 倍的物镜及适当滤光片的荧光显微镜观察玻片。 通常台盼蓝染色的细胞可见三种明显的形态：①正常的活细胞由于排斥台盼蓝 (附 录 3C ) 呈现清晰的白色盘状•，②早期凋亡的细胞由于排斥台盼蓝，而呈现不规 则 的 形 状 （像一团皱褶的纸）或呈现核固缩；③晚期凋亡或坏死的细胞呈现不规则 蓝染的细胞碎片。 吖啶橙染色的细胞，在窄带波长F T T C 的 滤 波 片 （520〜560n m ，表 2.14. 1 ) 下 呈现绿色，溴化乙锭染色的细胞在罗丹明滤光片下呈现红色；溴化乙锭和吖啶橙的 荧光在宽波F I T C 滤光片下可同时被看见。早期凋亡的细胞具有凋亡核的形态，但 由于此时细胞仍有完整的细胞膜，所以不被溴化乙锭染色。晚期凋亡和坏死的细胞 由于溴化乙锭染色D N A 和 R N A 而呈广泛的红色。坏死的细胞可通过其核的形态加 以区分。分裂间期的细胞为绿色荧光，其焚光密度的改变反映常染色体和异染色体 的分布。相对而言，凋亡的胞核在胞核周围呈高度浓缩的月牙状，或整个核呈现一
    个 或 一 簇 无 特 征 的 明 亮 的 圆 球 。 凋 亡 进 一 步 进 展 后 ， 细 胞 会 丢 失 D N A 或 变 成 像 爆 米 花 样 的 碎 片 ； 整 体 的 亮 度 将 低 于 正 常 细 胞 。 5.计数至少200个细胞，根据独特的染色质形态特征记录以下四种细胞状态的细胞数 目 （除非细胞已经发生程序性细胞死亡一段时间或已经破碎成凋亡小体）： 细 胞 状 态 / 胞 核 状 态 有活力/正 常 （V N ) 有活力/凋 亡 （V A ) 无活力/正 常 （N V N ) 无活力/凋 亡 （N V A ) 染 色 质 的 颜 色 ， 胞 核 的 特 征 凭绿色，有组织结构 亮绿色，高度浓缩或破碎 亮橙色，无凋亡核的特征 亮橙色，浓缩或破碎 根据下列公式计算凋亡细胞的比例（凋亡指数）和死细胞的比例： V A + N V A 凋亡指数= 细胞死亡率= V N + V A + N V N + N V A N V N + N V A XlOO V N + V A + N V N + N V A XlOO

    基 本 方 案 2 DNA裂解片段的定量

    该方法用于研究细胞毒性T 细 胞 （C T L ，单 元 2. 1 0 ) 和 自 然 杀 伤 细 胞 （N K 细胞，
    单 元 8. 6 ) 介导的凋亡的检测。

    材 料

    125I U d R 标记胞核51C r 标记胞质的T 细 胞 （见辅助方案2) 室温和冰冷的完全R PM I培养基 未标记的细胞毒性T 细 胞 （C T L ，单 元 2. 1 0 ; 可选使用） T T E 溶液 ••T E 缓冲液， p H 7. 4 含有 0.2% (V7 V ) 的 Triton X -100 (4°C 保存 6 个 月以上） Sorvall R T6 0 0 0 或相当的台式离心机 Beckman Gamma 500 计数系统 1 . 加 IOOmI 用 RPM I完 全 培 养 基 悬 浮 的 浓 度 为 5 X IO4 〜5 X IO5 个细胞/m l T 细胞到 1.5m l的离心管中，用于胞核和胞质的放射性标记，标 记 为 “B”。 2 . 与 IOOmI 的 RPM I完全培养基轻柔混匀用于检测自发释放，与 IOOiUl R PM I完全培养 基 中 IO4〜IO6 个的未标记的C T L 细胞混合用于实验组释放。 3 . 在室温， 50g离心5min以增加细胞之间接触。根据被检细胞的不同，在 37°C培养1〜8h。 4 . 向每个离心管中加入800W预 冷 的 RPM I完全培养基。室温， 200g离 心 IOmin使细 胞和大的团块沉淀。 5 . 小心吸取上清，放 入 标 有 “S”的管中，并放置一边。 6 . 在 标 记 “B ”的管中加入Iml T T E 溶 液 ，并剧烈振荡使细胞团块裂解，以最高速度 离 心 lOmin，使 D N A 片段与完整的染色质分离，小心吸取上清，放 入 标 有 “丁”的 管中，在沉淀中加入闪烁液用以计数。 7 . 使 用 P 液闪仪或Beckman G a m m a 5 0 0 的计数仪检测S 、 B 和 T 各管中51C r 和1251 的
    含 量 （如果使用G a m m a 500计数仪，125I 放射率二可变系数活性一51C r 系数活性）。 8 . 用以下公式计数自发组和实验组51C r 的 释 放 （即裂解）比例： 裂解比例=- S A S + B X I O O S 是 S 管中51C r 的 放 射 性 活 性 （cpm) (S +了 ）是 S 管 和 T 管中51C r 的放射性 活 性 （c p m )。 9 . 用以下公式计数自发组和实验组D N A 片 段 （即 Cpm125I) 的比例： D N A 片段比例= (S + T )/(S + T + B ) XlOO (S +了 ）是 S 管 和 T 管中未沉淀染色质的125I 的放射性 活 性 （cpm)， CS+ T + B ) 是 S 管 、 T 管 和 B 管中125I 的 放 射 性 活 性 （卬m )。 10. 用以下公式计算特异性裂解和D N A 片段的比例 特异性裂解或D N A 片段的比例= (d V (IOO- S)X 100 式 中 ， e 和 s 分别是根据上面的公式计数得到的实验组（与 C T L 共培养）和自发组 (单独R P M I 组 ；步 骤 2 ) 特异性裂解和D N A 片段的比例。

    备 选 方 案 计 数 放 射 性 标 记 的 DNA定 量 细 胞 中DNA 片段

    附 加 材 料



    悬于R P M I 完 全 培 养 基 （附 录 1 ) 的125I U d R 或3H T d R 标记的细胞/ml (见辅助方 案 2 或 3) 水溶性的闪烁液 0.1% (m /V ) SDS (适用于不能使用微量离心管的y 或 P 液闪仪） 7 液 闪 仪 （适用于3H T d R ) 1 . 根 据 实 验 需 要 将 D N A 分 离 成 B 、 S 和 T 三 个 部 分 （见 基 本 方 案 3，步 骤 1 〜 6)， 用125I U d R 或3H T d R 标记的细胞替换未标记细胞。 2 . 用适当的计数仪检测每部分的放射性活性。如果是125I U d R 标 记 D N A 可 用 7 计数 仪 ，如果是3H T d R 标 记 D N A ，可 用 p 液闪仪检测。如 果 仪 器 接 受 微 量 管 （如某些 7 计数仪）可计数微量管本身，如 果 仪 器 不 接 受 微 量 管 （如 P 液闪仪和 某 些 7 计数 仪），可 加 入 0. 5m l 的 1 % S D S 溶 解 D N A 并转移到适当的试管中再检测。 3 . 计算片段D N A 的 比 例 （见基本方案2 , 步 骤 9)

    辅 助 方 案 1 用125I UdR和51C r放射性标记细胞核

    材 料

    细胞悬液
    V R P M I -10完全培养基
    水溶性 lmCi/ml 碘 苷 （125I U d R ) (约 2000 Ci/m m o l ; ICNBiomedicals)
    R P M I 1640培养基 17m m X 100m m 聚苯乙烯离心管（Falcon) I E C 式 C R U -5000离 心 机 （或相当的） 7 计数仪 1.标记前一天，准备悬浮生长的传代培养细胞，用 R P M I -10完全培养基调整细胞浓度 为 I X l O 5〜4 X 105 个细胞/m l 。 2•将上述细胞悬液转移到17m m X 100m m 聚苯乙烯离心管中， 4°C ， 200g 离 心 IOmin 使细胞沉淀。吸弃上清，并 加 入 200M1 R P M I -10完全培养基，调 整 细 胞 浓 度 为 I X IO6〜4 X I O 6 个细胞/m l 。 3•加入 2〜IOjuCi 的水溶性 lmCi/ml 碘苷125I U d R (2〜20M1)， 37eC 培养 90〜120min。 如果除胞核外胞质也需要标记，则 在 培 养 的 后 60m i n 加 入 IOOiUCi的 5mCi/ml 51Cr， 使用双标的细胞只要求125I : 51Cr> 2 •• I0 4 . 用 IOml 37°C的 R P M I -10完全培 养 基 ，洗 涤 细 胞 3 次 ，按照基本方案中的需要用 R P M I -10重悬细胞到适当的浓度备用。 5 . 用 7 液闪仪检测10 〇〇〇个靶细胞的放射性活性以测定掺入量，如掺入量低于0.5〜 3cpm 1251/细胞和〇 .〇 5〜0.5cpm 51C r /每个细胞，应该检查是否有支原体感染（附录 3F ) 或用较低的活细胞的初始密度重新实验。

    辅 助 方 案 2 用3H TdR 放射性标记细胞核

    材 料

    待标记的细胞 V R P M I -10完全培养基 I m C V m l 3H T d R 水 溶 液 （2. OCi/m m o l ， ICNBiomedicals) R P M I 1640 培 养 基 （Life Technologies) ， 37°C 1. 用 R P M I -10完全培养基将待标记的培养细胞按浓度为I X IO5〜4 X IO5 个细胞/ m l 传 代培养。 2 . 向 处 于 生 长 期 的 细 胞 中 加 入 I m C i A n l 3H T d R 使 终 浓 度 为 0.5〜2mCi/m l ， 37°C ( 5 % C 0 2，可选） 培 养 12〜18h 。 3 . 用1〇 11111^； ^1 1640培养基在37°(：下 洗 涤 细 胞 3次 ，每次4°〇， 30(^离 心 511^。 4 . 按基本方案的需求用R P M I -10完全培养基重悬细胞调整到合适的细胞浓度。 5 . 用 P 液闪仪检测10 〇〇〇个靶细胞的放射性以确定3H 掺入量。如果掺入量低于0.2〜 3c p m /细胞，检查是否有支原体污染，或降低阴性对照组的活细胞初始密度重新实验。 6. 可选使用：如果需要，试验结果理想，用两个重复样本的平均值来计算细胞丢失的 比 例 （每个实验点重复样本中活细胞的数目变化不大于1 0 % 〜2 0 % ) 。
    ​

    来源：丁香实验

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