用有机溶剂固定细胞爬片、甩片或切片

所有的固定方案必须做到：

①防止抗原丢失；

②维持细胞正常结构；

③尽量使抗原保持能与抗体结合的状态。

常用的固定剂种类很多，固定剂的选择取决于被研究抗原的性质及所用抗体的特性。固定剂可分为两大类：有机溶剂和交联剂。有机溶剂，如乙醇和丙酮能够去除脂类物质，使细胞脱水，把蛋白质沉淀在细胞结构上。

交联剂一般通过自由氨基基团把生物分子桥连起来，形成一个相互连接的抗原网。两种方法均使蛋白质抗原部分变性。因此，在细胞染色中，能够识别变性蛋白的抗体更为有用。在某些情况下，甚至只有用此类抗体才能得到满意的结果。

往往凭经验选择固定剂。虽然许多人发现用交联剂固定细胞可以获得较好的结果，但没有通用规则可以参考。可以试用上述两种方法，然后选择较好的一种。

为了确定所用抗体是否能够识别固定后的抗原，最简单的方法是用标准免疫染色法去检测。将固定后的抗原纯化后，对抗体进行测试，虽然这是一个可行的方法，但一般情况下，没有必要这样做。然而，假如抗原经固定后，多种抗体均不能识别，则考虑用此方法去弄清原因。

在有机溶剂中，乙醇和丙酮或二者等体积的混合液常用作固定剂。它们能溶解细胞膜脂质，洗掉可溶性分子并使细胞脱水。用于固定细胞能够去除胞浆中氨基肽酶和核酶，暴露细胞结构。所有用作固定细胞的有机溶剂均具有较强的吸水性，能使细胞脱水并且沉淀细胞蛋白质。这使得抗原所在的局部亚细胞结构清晰，易被观测。

各种有机溶剂对不同的抗原的影响程度是不同的。如果缺乏有关所研究抗原的资料，建议开始时使用50%丙酮和50%甲醇混合液。其固定方法为：

①将玻片浸入50%丙酮和50%甲醇混合液固定液中，然后静置2min；

②弃去固定液，用PBS冲洗。此时，标本可加入抗体。

某些抗原用酸化乙醇溶液固定后，抗原与抗体反应的能力得到增强，因此有些实验室常用这种固定方法。这种方法也可用于检测淋巴样细胞的抗体。尽管如此，酸化乙醇固定法也可能使某些抗原的抗原性遭到破坏，所以当检测一种未知抗原或使用某种新的一抗时，这种方法不应该是首选的固定方法。

此外，除了上述有机溶剂之外，还可以用5%冰乙酸、95%乙醇，其固定方法为：于-20℃下固定5min，然后用常规方法洗涤。

~undefined注意 ：用有机溶剂固定的细胞标本可在-70℃保存。其方法为：在固定完毕后，取出标本片，置空气干燥（不用PBS洗），干燥后的标本于-70℃密封保存。对于多数抗原，在解冻时必须小心，以防被破坏。先将标本转移至50%甲醇和50%丙酮的混合液中（干冰预冷），然后将此混合液转移至室温下。

当固定液温度达室温时，取出标本，用PBS冲洗后，即可加入抗体。

~undefined常见问题 ： 这种方法所面临的一个主要问题是有机溶剂固定细胞会扭曲细胞的一些特性。这种固定液会破坏所有膜结构和大部分蛋白质结构，使亚细胞结构遭到破坏。改用其他固定剂或其他固定方法可能克服此类问题。实验者应知道，在一定程度上，所有固定液都存在上述问题。

另一个可以选择的方法是用绿色荧光蛋白和检测抗原蛋白制备一种融合蛋白表达载体，然后将此载体转入待测细胞中。通过仔细操作，使融合蛋白中的抗原蛋白表达水平和天然状态下表达水平相近，这一点非常重要。应当将融合蛋白视为所检测抗原的一种突变体。然而，用多种方法对亚细胞结构的检测结果要比仅用一种方法更可靠。