PCR及RT-PCR之基础问题解答

1、问题：RT-PCR灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。

可能原因：

1）RNA被降解

建议解决方法：

在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA使用良好的无污染技术分离RNA；

在将组织从动物体取出后立刻处理在100％甲酰胺中储存RNA；

如果使用胎盘RNase抑制剂，不要加热超过45℃或pH超过8.0，否则抑制剂或释放所有结合的RNase。而且，在≥0.8mM DTT时加入RNase抑制剂，一定要存在DTT。

2）RNA中包含逆转录抑制剂

建议解决方法：

通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70％（v/v）乙醇对RNA沉淀进行清洗。可以加入糖元（0.25μg到0.4μg/μl）以帮助小量样品RNA的恢复。

逆转录抑制剂包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸钠，spermidine，甲酰胺和胍盐。

将对照RNA同样品混合，同对照RNA反应比较产量以检验抑制剂。

3）多糖同RNA共沉淀

建议解决方法：

使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。

4）用于合成cDNA第一链合成的引物没有很好退火

建议解决方法：

确定退火温度适合您的引物。对于随机六聚体，建议在反应温度保温之前先在25℃保温10分钟。

对于基因特异性引物（GSP），可以试一下其他GSP，或换用oligo(dT)或随机六聚体。

确定GSP是反义序列。

5）起始RNA量不够

建议解决方法：

增加RNA量。

对于＜50ng的RNA样品，可以在第一链cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA。

6）RNA模板二级结构太多

建议解决方法：

将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火。

提高逆转录反应温度，对SuperScriptⅡ可以到50℃，对ThermoScript可以到65℃。

注意：不要在＞60℃时使用oligo(dT)引物，选择一个在反应温度可以退火的GSP。对于＞1kb的RT-PCR产物，保持反应温度≤65℃。

注意：不要在高于37℃时使用M-MLV。

如果不需要全长cDNA，在第一链反应中使用随机引物。

7）引物或模板对残余的RNA模板敏感

建议解决方法：

在PCR前用RNaseH处理。

8）靶序列在分析的组织中不表达

建议解决方法：

尝试其他靶序列或组织

9）PCR没有起作用

建议解决方法：

对两步法RT-PCR，不要在PCR步骤中使用超过1/5的逆转录反应产物。

2、问题：PCR灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。

可能原因：

1）PCR引物设计较差

建议解决方法：

避免在引物3'端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。

2）DNA含有抑制剂

建议解决方法：

诸如DMSO，SDS和甲酰胺之类的试剂会抑制Taq DNA聚合酶。如果怀疑污染了抑制剂，可以使用乙醇沉淀DNA。

3）富含GC的模板

建议解决方法：

对于GC含量＞50％的模板，使用PCRx Enhancer Solution。

4）模板浓度太低

建议解决方法：

使用104拷贝的靶序列，以在25到30个循环中获得信号。

建议解决方法：

从1mM到3mM，间隔0.5mM进行一系列反应，确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。注意：对实时定量PCR，使用3mM到5mM的镁离子浓度。

6＝退火温度太高

建议解决方法：

使用表4的公式估算Tm，把退火温度设定为低于Tm 5℃。因为这些公式只是估算Tm值，所有真正的退火温度实际会高些或低些。

7＝引物浓度太低

建议解决方法：

最佳引物浓度介于0.1μM到0.5μM之间。为了精确确定引物浓度，在260nm测量光密度，然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。

3、问题：RT-PCR特异性：在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带。

可能原因：

1＝物和模板非特异性退火

建议解决方法：

在第一链合成中使用GSP，而不是随机引物或oligo(dT)。

试用允许高温cDNA合成的GSP。

2＝GSP设计较差

建议解决方法：

遵循用于扩增引物设计的同样原则

3＝RNA中沾染了基因组DNA

建议解决方法：

使用扩增级DNaseⅠ处理RNA。使用没有逆转录的对照反应检测DNA污染。

4、问题：PCR特异性：在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带。

可能原因：

1＝形成引物二聚体

建议解决方法：

设计在3'端没有互补序列的引物。

2＝引物和模板非特异性退火

建议解决方法：

以2℃到5℃间隔增加退火温度，减少退火时间。

在开始几个循环使用较高的退火温度，然后使用较低的退火温度。

使用Platinum Taq DNA进行自动热启动PCR。

避免在引物3'端含有2到3个dG或dC。

3＝镁离子浓度太高

建议解决方法：

对于每一个模板和引物组合优化镁离子浓度。

4＝因为扩增复杂模板导致引物错误起始

建议解决方法：

使用巢式PCR或递减PCR。

5＝沾染外源DNA

建议解决方法：

使用抗气雾剂的tip和UDG。

6＝因为二级结构导致引物结合位点无法接近

建议解决方法：
对于GC含量＞50％的模板，使用（1×-3×）PCRx Enhancer Solution。

5.问题：PCR忠实性：PCR在产物序列中引入了错误

可能原因：

1＝聚合酶忠实性低

建议解决方法：

使用带有校正活性的热稳定聚合酶，如Platinum Pfx DNA聚合酶。

2＝循环数太多

建议解决方法：

降低循环数。

3＝四种dNTP的浓度不同

建议解决方法：

制备新的dNTP混合物，保证四种核苷浓度相同。使用预混合物。